浙江大学细胞工程第四章课件.pptVIP

人体内的五种抗体 第三十页，共五十七页。 4.32单克隆抗体的制备 单克隆抗体(monoclonal antibody，简称McAb)：将能够产生抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。 第三十一页，共五十七页。 单抗的制备过程 动物免疫与亲本细胞的选择 细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备 杂交瘤细胞的筛选：有限稀释法等 单克隆抗体的制备和冻存 单克隆抗体的纯化 第三十二页，共五十七页。 亲本细胞的选择 骨髓瘤细胞：一般不分泌抗体，能在体外无限繁殖和连续继代培养，且为HPRT－或TK－。多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤细胞。 第三十三页，共五十七页。 淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠或小鼠。 免疫方法：体内法或体外法。 体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。3－4天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在95％以上的可以用于融合。 体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为107个/ml，加适当浓度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴细胞。 第三十四页，共五十七页。 细胞融合 将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2：1或10：1的比例混匀于50ml锥形离心管内，1200rpm离心7—10分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层，在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%的PEG 0.5ml，随后静置90秒，再于5分钟内边振摇边逐滴加入5－10ml不含血清的培液或盐水缓冲液，以终止PEG的作用，再静置10分钟。 第三十五页，共五十七页。 HAT培养基筛选杂交瘤细胞 细胞团块分散后，加HAT溶液，稀释至骨髓瘤细胞不超过2×105 ml，即可加入有饲养细胞的96孔塑料培养板内每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；总量分别为0.2ml和1ml。 用HAT选择性培养时每隔2－3天半量换液，7天后可以选择出杂交瘤细胞。 第三十六页，共五十七页。 细胞融合的选择示意图 第三十七页，共五十七页。 HAT选择系统 HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。 DNA合成途径有两种。 第三十八页，共五十七页。 杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。 HPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生； TK- 细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。 含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。 第三十九页，共五十七页。 嘌呤合成通路的阻断 第四十页，共五十七页。 4.1细胞融合 4.2杂种细胞的遗传特性和应用 4.3淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体技术 第一页，共五十七页。 4.1细胞融合 4.11聚乙二醇介导的细胞融合 4.12细胞电融合 4.13杂种细胞的筛选 第二页，共五十七页。 第三页，共五十七页。 4.11 聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合 原理：PEG带有大量的负电荷,和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下，形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH,高钙离子的溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。 第四页，共五十七页。 第五页，共五十七页。 第六页，共五十七页。 双向电泳：在交流电场的作用下（1MHz，150V/cm）细胞膜上正负电荷分离，产生偶极，两个极化的细胞会发生相互的紧密接触。 第七页，共五十七页。 可逆电降解：在高频电场的脉冲作用下（50ms，电场强度1.2－2kV/cm），细胞膜上的离子发生位移，而使电荷分开，细胞质膜产生电势，正、负电荷相互吸引，细胞膜变薄，随细胞势的增加，膜降解穿孔，形成微孔。 电场诱发的微孔面积和数目与细胞膜总表面积相对不大时，微孔可以重新封闭。 第八页，共五十七页。 电场示意图 第九页，共五十七页。 甜菜原生质体电融合过程 1）在高频电流电场下的相互接触。 2）脉冲刺激后30s 3)50秒后 4）1.5分钟后 5）6分钟后 6）15分钟后，原生质体融合完成。 第十页，共五十七页。 注意事项 1）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质。 2）注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间，以防止细胞