实验酶切连接及电泳检测详解演示文稿.pptVIP

T4 DNA连接酶作用机制： T4 DNA连接酶作用分三步： (1) T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶－AMP复合物。 (2) 酶－AMP复合物结合到具有5’－磷酸基和3’－羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。 (3) 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来. 第三十页，共四十七页。 常用的DNA连接酶是T4 DNA连接酶，其作用底物是双链的DNA分子或RNA：DNA杂交分子，可以连接粘性末端、平末端。 T4 DNA连接酶的活性用Weiss单位表示。 1 Weiss单位是指在37℃下20min内催化1nmol 32P从焦磷酸根置换到 [γ,β-32P] ATP所需的酶量。 第三十一页，共四十七页。 T4DNA连接酶的最适反应温度为３７℃，为什么实验中采用１２～14℃？ 1.粘性末端形成的氢键在低温下更稳定； 2. 连接反应时间长，低温下酶不容易失活 第三十二页，共四十七页。 材料、试剂及器具 1、材料与试剂 连接反应： λDNA/EcoT14 I :由11条DNA片段组成：19329、7743、6223bp、4254、3472、 2690、1882、1489、925、421、74 bp T4 DNA连接酶及其配套的 10×连接缓冲液 检测： 0.5×TBE电泳缓冲液 6×电泳载样缓冲液 、Goldview、琼脂糖 第三十三页，共四十七页。 2 、器具： 水平式电泳装置 电泳仪,台式高速离心机 恒温水浴锅（用PCR仪代理） 微量移液枪 微波炉或电炉 紫外透射仪 照相机及其附件 第三十四页，共四十七页。 实验酶切连接及电泳检测详解演示文稿 第一页，共四十七页。 （优选）实验酶切连接及电泳检测 第二页，共四十七页。 质粒在正常情况下以共价闭合环状cccDNA构型(超螺旋scDNA)存在，在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状/超螺旋DNA(cccDNA)；开环DNA(ocDNA）；线形DNA(LDNA) 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图 关于电泳条带 第三页，共四十七页。 质粒DNA的带型分析 M pUC19 环形质粒DNA 超螺旋粒DNA 第四页，共四十七页。 出现问题 电泳条带浓度和纯度 电泳条带拖尾现象（加样过多，离子浓度，胶未完全凝固） 质粒DNA的带型分析 第五页，共四十七页。 实验六DNA的酶切、连接及电泳检测 第六页，共四十七页。 实 验 步 骤 （一）质粒DNA酶切(注：每人一管） 在200μl 的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：μl） ↓ 混匀；点动离心将反应液甩至管底。37℃(PCR仪)保温1-2h进行酶切反应。 ↓ 反应结束后， 75℃，保温10min使酶失活。 ↓ 电泳检测 ? 样品代号 成份 反应1（标准pUC19) ddH2O 无菌水(μl) 7 pUC19 质粒(μl) 10 10*H 酶切缓冲液(μl) 2 E EcoRI酶(μl) 1.0 Total(μl) 20 第七页，共四十七页。 酶切 样品代号 成份 反应（标准pUC19) ddH2O 无菌水(μl) 7 pUC19 质粒(μl) 10 10*H 酶切缓冲液(μl) 2 E EcoRI酶(μl) 1.0 Total(μl) 20 第八页，共四十七页。 （二） DNA片段的连接(注：每人一管） 取200 μl的离心管按下表加入试剂。 ↓ 混匀后点动离心，将溶液甩至管底 ↓ 置于已调好温度为12℃-16℃PCR仪中 ↓ 保温1-2h后取出 ↓ 电泳检测 样品代号 成分 用量（μl） ddH2O ddH2O 7.0 T14 λDNA/EcoT14 I片段 10.0 10*T4 连接缓冲液 2.0 T4 T4DNA连接酶 1.0 总体积 20 第九页，共四十七页。 连接 样品代号 成分 用量（μl） H ddH2O 7.0 T14 λDNA/EcoT14 I片段 10.0 Buffer 连接缓冲液 2.0 T4 T4DNA连接酶 1.0 总体积 20 第十页，共四十七页。 （三）质粒酶切样品和DNA连接样品的电泳检测 琼脂糖凝胶的制备：制备2块0.7% （0.28g/40ml）和2块1.2%琼脂糖凝胶（0.48g/40ml）。 （注：全班制备4块胶） 第十一页，共四十七页。 1、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立； 2、了解影响酶切的因素； 3、掌握DNA连接酶的性质以及连接体系的建立； 4、了解影响连接反应的因素。 实 验 目 的 第十二页，共四十七页。 通过D