免疫组化讲课原理及方法.pptVIP

免疫组化染色方法的类别 直接法 间接法 PAP法 ABC法 LSAB法 一步法（EPOS） 两步法（Envision） 当前30页，共73页，星期日。 直接法 将荧光、酶、金直接标记在一抗上进行显色，没有联结系统、未用桥抗体。 优点：特异性高、非特异染色轻。 缺点：敏感性低，要求抗体浓度高。每种一抗均需用酶来标记 当前31页，共73页，星期日。 当前32页，共73页，星期日。 间接法 将标记物标记在桥联抗体上（即二抗、三抗） 一抗往往是兔身上产生的多克隆抗体，其酶标抗体必须是针对兔 优点：敏感性高，只需少数几种动物的二抗就可以和所有一抗相匹配 缺点：特异性差 当前33页，共73页，星期日。 Primary Antibody Secondary Antibody Substrate-chromogene solution 当前34页，共73页，星期日。 PAP法（Peroxidase-AntiPeroxidase，过氧化酶-抗过氧化酶法） 组成： 一抗是针对靶抗原的特异性抗体 二抗是联结抗体，一面联结一抗，另一面联结PAP复合物 三抗是以过氧化物酶为抗原，在与一抗同种动物身上诱发产生的抗体，并与辣根过氧化物酶形成复合物（PAP） 当前35页，共73页，星期日。 PAP法（Peroxidase-AntiPeroxidase，过氧化酶-抗过氧化酶法） 优点： PAP复合物中含酶更多，且是一种非标记的免疫组化方法，敏感性更高 PAP复合物常来自两种不同的动物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗为单克隆抗体的染色，兔PAP多用于一抗为多克隆抗体的染色 可用于福尔马林固定的石蜡切片 当前36页，共73页，星期日。 PAP Primary Antibody Secondary Antibody Peroxidase-anti-Peroxidase Substrate-chromogene solution 当前37页，共73页，星期日。 ABC法（Avidin-Biotin Complex，亲和素-生物素法） 组成： 一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和素+酶标生物素） 优点： 亲和素和生物素有强大亲和力，使其比直接和间接酶标法更敏感，也超过PAP法。 能用于常规石蜡切片。 当前38页，共73页，星期日。 亲和素—生物素复合物（ Avidin-Biotin Complex ABC ） 亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合 亲和素-生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体联接第一抗体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高此生物反应的敏感性和特异性 AB复合物多用于ABC法的免疫组化中 当前39页，共73页，星期日。 ABC法（Avidin-Biotin Complex，亲和素-生物素法） 当前40页，共73页，星期日。 一抗 二抗 ABC DAB ABC 当前41页，共73页，星期日。 ABC与PAP 法的比较 当前42页，共73页，星期日。 LSAB（SP）法（labelled streptavidin biotin method）标记的链霉亲和素-生物素法 特点：将HRP直接标记于链霉亲和素上 优点： 更快速：空间结构更小 更敏感：链霉亲和素的亲和性更强，更易于到达深部位点 非特异背景更少：链霉亲和素空间结构特殊，不易与高荷电的组织成分（胶原纤维、结缔组织）联结 当前43页，共73页，星期日。 酶标亲和素（Labelled streptavidin） 在AB复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此LSAB法比ABC法更敏感 当前44页，共73页，星期日。 SP Primary Antibody Biotinylated Secondary Antibody Ensyme-conjugated Streptavidin Substrate-chromogen solution 当前45页，共73页，星期日。 ABC与LSAB(SP)法的比较 当前46页，共73页，星期日。 一步法（EPOS）及两步法（Envision） 特点 以多聚体为载体，联结了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法） 优点 操作简便，省时 提高了敏感性和特异性 减少了背景着色 避免内源性生物素的干扰 当前47页，共73页，星期日。 多聚物载体 一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKO EPOS及DAKO Envision试剂 核