pcr扩增的原理和步骤.docxVIP

PCR 技术的原理与反应步骤 20 世纪 70 年代末，随着DNA 重组技术的产生和发展，如何快速获得目的基因(待检测 或待研究的特定基因)片段已经成为瓶颈问题。1983 年 K.Mullis 发明了聚合酶链反应(PCR) 技术。该技术可将微量DNA 片段大量扩增，使微量DNA 或 RNA 的操作变得简单易行。 PCR 技 术的高敏感、高特异、高产率、可重复、 快速简便等优点使其迅速成为分子生物学研究中应 用最为广泛的方法，许多以往无法解决的分子生物学研究难题得以解决。PCR 技术的发明是 分子生物学的一项革命， 极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展， 成为分子生物 学与医学的支撑技术。PCR 技术的发明者 Kary Mullis 为此获得了 1993 年的诺贝尔化学奖。 近年来， PCR 技术不断改进，从手工操作发展到自动化仪器，从定性分析发展到定量测 定。该方法与其他分子生物学技术相结合，其用途日益广泛。新的PCR 技术类型层出不穷。 一、 PCR 技术的工作原理 PCR 的基本工作原理是在体外模拟体内 DNA 复制的过程。以待扩增的 DNA 分子为模板， 用两条寡核苷酸片段作为引物， 分别在拟扩增片段的 DNA 两侧与模板 DNA 链互补结合， 提供 3-0H 末端；在DNA 聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成两条 新链的合成。不断重复这一过程，即可使目的DNA 片段得到扩增。 PCR 反应的特异性依赖于 与模板 DNA 两端互补的寡核苷酸引物。组成PCR 反应体系的基本成分包括模板 DNA、特异引 物、耐热性 DNA 聚合酶(如 TaqDNA 聚合酶)、dNTP 以及含有 Mg2+的缓冲液。 PCR 是体外酶促合成特异 DNA 片段的方法。每个PCR 体系均包括 4 种主要成分：含有待 扩增序列的 DNA 模板、引物(primer)、TaqDNA 聚合酶(TaqDNA polymerase)和脱氧核糖 核酸三磷酸(dNTP)。 PCR 的基本反应步骤包括高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成： ①高温变性：将反应体系加热至 95℃，使模板 DNA 完全变性成为单链，同时引物自身 以及引物之间存在的局部双链也得以消除； ②低温退火：将温度下降至适宜温度(一般较Tm 低 5℃，约 50-65℃)，两条人工合成 的寡核苷酸引物与互补的单链 DNA 模板结合，形成部分双链，使引物与模板DNA 结合； ③适温延伸：将温度升至TaqDNA 聚合酶的最适温度72℃， DNA 聚合酶以引物 3端为合 成的起点，以单核苷酸 dNTP 为原料，沿模板以 5→3方向延伸，催化DNA 的合成反应，合 成 DNA 新链。 PCR 扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。在第一轮反应周期中，以两条互 补的 DNA 为模板，引物附上模板的 3-端，即新生链的 5-端是固定的，其 3-端则没有固 定的止点，产生“长产物片段”。进入第二轮循环，新延伸片段的起点和终点都限定于引物 扩增序列以内，形成长短抑制的“短产物片段”。短产物片段的长度严格地限定在两个引物 链 5-端之间， 是需要扩增的特定片段。 “短产物片段”按指数倍数增加， 而 “长产物片段” 几乎可以忽略不计。 这样， 每一双链的 DNA 模板，经过一次解链、 退火、 延伸三个步骤的热循环后就成了两 条双链 DNA 分子。 如此反复进行， 每一次循环所产生的 DNA 均能成为下一次循环的模板， 每 一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA 特异区拷贝数扩增 1 倍，PCR 产物得以2n 的指数 形式迅速扩增，经过 25-30 个循环后，理论上可使基因扩增 109 倍以上，实际上一般可达 106~107 倍。与其他分子生物学技术相比， PCR 具有效率高、敏感性高、特异性强、快速、简 便等优点；不足之处是需要严格的实验条件，如果使用不当，易有假阳性和假阴性。 实时荧光定量 PCR (real-time fluorescent quantitative PCR)技术是在 PCR 反应体 系中加入荧光试剂， 利用 PCR 产物形成的荧光信号实时检测 PCR 进程， 最后通过标准曲线对 未知模板进行定量分析的方法。 实时荧光定量 PCR 能够专一、 灵敏、快速、高重复性地精确 定量起始模板浓度。 二、 PCR 技术的主要用途 (一)获得目的基因片段 PCR 技术为在重组 DNA 过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。 在人类基因组 计划完成之前， PCR 是从 cDNA 文库或基因组文库中获得序列相似的新基因片段或新基因的 主要方法。 目前， 该技术是从各种生物标本或基因工程载体中快速获得已知序列目的基因片 段的主要方法。 (二) DNA 和