PCR实验室(相关资料).docxVIP

. PCR ：即聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，利用 DNA 在体外95℃时解旋(变 性) ，55℃时引物与单链按碱基互补配对的原则结合 (退火) ，再调温度至 72℃左右， DNA 聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链(延伸)。 PCR 仪实际就是一个温控设备，能在 95℃， 55℃， 72℃之间很好地进行温度控制。根 据 DNA 扩增的目的和检测的标准可以将 PCR 仪分为： 普通 PCR 仪，梯度 PCR 仪，原位 PCR 仪， 实时荧光定量 PCR 仪等几类。 普通 PCR 仪： 一般把一次 PCR 扩增只能运行一个特定退火温度的 PCR 仪，称之为普通 PCR 仪，也就是传统的 PCR 仪。如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。 普通 PCR 仪主要应用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等。 如:启步 BSW-2P,BSW-3P,ABI 2720 型 梯度 PCR 仪： PCR 反应能否成功， 退火温度是关键， 梯度 PCR 仪每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置， 根据结果， 一步就可以摸索出最适反应条件。 一次性 PCR 扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(通 常 12 种温度梯度)的称之为梯度 PCR 仪。 不同的 DNA 片段其最适合的退火温度不同，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次 性 PCR 扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。 梯度 PCR 仪主要用于研究未知 DNA 退火温度的扩增，这样既节约时间，也节约成本。在不设置 梯度的情况下亦可当做普通的 PCR 用。 梯度 PCR 仪多应用于分子生物学、医学、食品工业、司法科学、生物技术、环境科学、微生物学、 临床诊断、流行病学、遗传学、基因芯片、基因检测、基因克隆、基因表达等领域以聚合酶链式反应 (Picymerase Chain Reaction , PCR)为特征的、以检测DNA/RNA 为目的的各种病原体检测及基因分 析。 如:启步 BSW-2T,BSW-3T,ABI 9700,ABI Veriti, Bio-Rad T100 型 原位 PCR 仪： PCR 是提取细胞或组织中的 DNA 进行基因扩增反应，而原位 PCR 是保持细胞或组织的完整性， 使 PCR 反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA 所在的位置上进行基因扩增。不但可以检测到 靶 DNA，而且还可以了解靶 DNA 存在于何种细胞中，更有利于探讨靶 DNA 与细胞之间的关系。 原位 PCR 仪主要应用于：(1)检测外源性基因片段，提高检出率，集中在病毒感染的检查上，如 HIV 、HPV、HBV 、CMV 等；(2)观察病原体在体内分布规律；(3)内源性基因片段，如人体的单基 因病、重组基因、易位的染色体、 Ig 的 mRNA 片段、癌基因片段等；(4)检测导入基因；(5)遗传 病基因检测如β－地中海贫血。 ；. . 实时荧光定量 PCR 仪： 在普通 PCR 仪设计基础上增加荧光信号采集系统和计算机分析处理系统， 形成了具有荧光定量功能 的 PCR 仪器。其 PCR 扩增原理和普通 PCR 扩增原理相同，在 PCR 扩增时加入的引物是利用同位素、 荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系 统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统，得出量化的实时结果输出。 荧光定量 PCR 仪有单通道，双通道和多通道之分。当只用一种荧光探针标记的时候，选用单通道； 有多种荧光标记的时候使用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记和目的基因表达产物，因为一次只 能检测一种目的基因的扩增量，需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重 PCR，实现一次检测多种目的基因的功能。 荧光定量 PCR 仪主要应用于临床医学检测、生物医药研发、食品行业、科研院校等。荧光定量检 测技术在临床诊断方面很多， 主要集中在各种病原体引起疾病的临床诊断， 如肝炎类疾病、性病、 与优 生优育相关的疾病以及肺结核等等。 通道： channel 指的是针对每一种荧光的检测器，比如你在一个管中做多个颜色，针对多个靶基因。每 个颜色需要一个检测器来检测荧光信号的强弱，每一个针对不同颜色的检测器，就是一个通道。在使用 有些厂家 5 通道的荧光定量仪时， 为了确保实验结果的精确性和准确性都要在实验中使用 ROX (一种荧 光染料， ROX 是作为内参的，即参照和校正实验结果。在ABI 的机器里显示为红色的水平线。如果你 的扩增线在刚开始的时候就高于 ROX 证明有基因组 DNA 污染。)或专用的 Reference dye ，这些荧 光染料都必须单独使用一个检测通道。这样以