丝氨酸羟甲基转移酶电泳制备.pptVIP

项目四 丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备;背景知识;1、电泳是指带电颗粒在电场中将受到电场力的作用而发生泳动。 2、这种特性，用电泳的方法对这些物质进行定性及定量分析，也可用于混合物的分离 3、凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法 ;按分离原理：区带电泳、移界电泳、等速电泳和聚焦电泳4种 区带电泳：电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液中 分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。 区带电泳分类： 按支持物物理性状分类 1. 滤纸及其他纤维素膜电泳。 2. 粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。 3. 凝胶电泳，如琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 4. 丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。 按支持物的装置形式不同分类 1. 平板式电泳 2. 垂直板式电泳。 3. 连续流动电泳 按pH的连续性不同分类 1. 连续pH电泳：电泳全部过程中缓冲液pH保持不变。 2、不连续pH电泳;凝胶电泳技术;二、聚丙烯酰胺凝胶电泳;三、实验原理;三、实验原理;5、聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 6、TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；AP中含有29的丙烯酰胺和1的甲叉基聚丙烯酰胺，能产生自由氧基，使丙烯酰胺聚合。 7、十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 ;夹心垂直板电泳槽示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统 ;丝氨酸羟甲基转移酶电泳制备;四、仪器、原料和试剂; （3）30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr） 30g及N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃保存。 （4）10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。 （5）10%SDS溶液：SDS在低温易析出结晶，用前??热，使其完全溶解。 （6）1%TEMED；; （7）10%过硫酸铵（AP）：现用现配。 （8）电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取Tris 6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L。 （9）样品溶解液：取SDS 100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至10mL（遇液体样品浓度增加一倍配制）。用来溶解标准蛋白质及待测固体。 （10）染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。 （11）脱色液：75mL冰乙酸，875mL重蒸水与50mL甲醇混匀。;五、实验步骤;五、实验步骤;丝氨酸羟甲基转移酶电泳制备;3．制备凝胶板： （1）分离胶制备：按表配制20ml 10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm高，以进行水封。约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。 （2）浓缩胶的制备：按表配制10ml 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合，再放置20—30min。待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。 ;4．样品处理及加样 各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5~1mg/mL，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1分钟，以消除亚稳态聚合。 一般加样体积为10－15μL（即2－10μg蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。 ;5．电泳 将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA。待样品进入分离较时，将电流调至20－30 mA。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，