第六章基因克隆.docx

PAGE PAGE # 第六章 基因工程 （上游） 大体步骤 目的基因表达 原核细胞 「真核细胞 连接产物导入细胞一哺乳动物细胞 : 植物细胞 「各种质粒 目的基因与载体连接一各种病毒 『皆经改造 A L 「逆转录PCR法 获取目的基因亠PCR法 (直接调用法 ZrA- -H- 弟—T 获得目的基因 PAGE PAGE # PAGE PAGE # 1.直接分昌目的DNA 经限制酶切割，电泳分离DNA片断。 适用于获得细菌、质粒、病毒等低等生物 的基因片段。 真核生物的染色体DNA中含有内含子 序列，不适合于基因工程的需要。 2. cDNA文库 以mRNA为模板，逆转录合成的互补DNA。以 此得到的某种细胞内所有mRNA的cDNA,称 为cDNA文库。 3. RT-PCR 基本原理： 将细胞中mRNA逆转录为cDNA,以cDNA 为模板，进行PCR反应。 mRNA f cDNA —? PCR产物 第二节重組DNA分子的构建 一.目的基因与载体的连接 Link of cohesive end Basenpaarung Ligation 粘末端连接 Link of blunt end -^O-CrO-O Ligation 平末端连接 PAGE PAGE # PAGE PAGE # 平末端连接 PAGE PAGE # PAGE PAGE # 平末端连接的缺点 *more difficult ligation 连接困难 ^2-direction insertion 双向插入 ^self-reconnection 自身环化 *no easy way of retrieving the insert 重新筛选插入的片断困难 vectorvector vector 平齐末端连接时，插入的方向是 随机的，称为双向插入。会给后续 的工作造成很多麻烦。 PAGE PAGE # PAGE PAGE # 单酶切粘末端连接 EcoRIEcoRI EcoRI SB- 5 Misitiatch , C 二: w抑;彳” ?.?』天七.七f. Fg起：m； Recombinant DMA ；EF5，? EeoRI i r PAGE PAGE # PAGE PAGE # 单酶切粘末端连接的特点 优 点+Using the same one enzyme to cut 用同一种酶切 ^Ligated easily and coveniently 连接容易方便 缺点*Self?reconnection of vector 载体自身环化 ^Inserted in two directions 双向插入 单酶切粘末端的双向插入 AATTC 一G G ^^^^?CTTAA EcoRI Hindlll EcoRI Hindlll 双酶切粘末端连接 双酶切粘末端连接的特点 *Using the same two enzymes to cut ^Ligated easily and conveniently *no self-reconnection of vector ^Inserted in one direction 定向 插入 缺点操作比较麻烦。如果两种酶要求的条件 不同，需要进行两个阶段的反应。 几种实验方法 ?利用相应的技术方法，使实验顺利 进行。 Linearized plasmid + dGTP terminal transferase GGGGGGG GGGGGGG Link of homopolymeric cDNA 末端转移酶 + dCTP r GGGGGGG CCCCC CCCCC GGGGGGG ccccc I tails 添加同聚尾避免质粒的自身环化 PAGE PAGE # PAGE PAGE # cDNA Linker GAATTC GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI AATTC G CTTAA 添加接头，弓I入限制酶的切割 位点，然后用相应的酶切割。 PAGE PAGE # PAGE PAGE # 第三节重组子导入细胞 野生型细菌具有针对外源DN A的限制和 修饰系统，会切割外源DNA分子。因此用于 基因工程的受体菌，需经筛选和人工改造。 ?外源DNA转入细胞的过程叫做转化。但 不包括由病毒介导的DNA转入。常用的 方法有如下： The first is a chemical method utilizing CaCl2 and heat shock to promote DNA entry into cells. 氯化钙法：利用氯化钙和