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NOR转录因子的氧化还原修饰调控番茄果实成熟 导读 转录因子（TFs）是一种结合DNA的蛋白质，在基础生物学进程中发挥重要作用，包括细胞分化、信号转导、应激反应等。转录因子通过与靶基因的启动子结合激活/抑制靶基因表达，或进行翻译后修饰（PTMs）响应发育变化。翻译后修饰机制包括乙酰化、磷酸化、泛素化/类泛素化、亚硝基化，这些修饰影响转录因子蛋白稳定性和DNA结合活性，从而影响其对靶基因的调控。 研究表明转录因子的氧化还原修饰在应激反应中发挥重要作用，蛋白质在应激条件下容易氧化损伤，而氧化蛋白在一定条件下可修复。拟南芥AtTCP15、AtbZIP16、AtbZIP68、AtGBF1的氧化修饰显著降低其DNA结合活性，而氧化的AtBZR1促进与AtARF6和AtPIF4的相互作用，增强转录活性。硫氧还蛋白介导的NPR1氧化还原修饰改变其亚细胞定位并调节植株抗病性。氧化还原修饰主要与蛋白质中半胱氨酸氧化或巯基与二硫键之间的转换有关。蛋白质中的甲硫氨酸也受氧化修饰，及磺化氧化作用（Met-SO），可被Met亚砜还原酶（MsrA/B）修复。 番茄（Solanum lycopersicum）是重要经济作物之一。番茄果实二倍体遗传简便、全基因组注释清晰、生活史短，是研究果实成熟机制的良好模式植物。在番茄中，NOR转录因子调控乙烯通路，从而调控果实成熟。酵母双杂交系统发现Met亚砜还原酶与NOR转录因子互作。本研究表明NOR是Met亚砜还原酶的靶蛋白，氧化作用降低NOR转录因子的DNA结合能力，抑制番茄果实成熟。 实验设计 结果 1??番茄果实的成熟特性 果皮呈红色是番茄果实成熟的重要特征。番茄果实在开花期后39d呈红色（图1A），乙烯水平快速增加（图1B），番茄红素积累（图1C）。果实开裂阶段过氧化氢积累显著增加，蛋白质羰基含量迅速增加（图1D-E）。因此，活性氧积累和蛋白质氧化还原状态可能与番茄果实成熟有关。酵母双杂交显示NOR转录因子与SlMsrB2（Met亚砜还原酶）相互作用，果实成熟过程中SlMsrB1和SlMsrB2表达上调，E4和SlMsrB2表达上调幅度远高于其他Msr基因，NOR与SlMsrB2的表达模式相似（图1F）。因此，SlMsrB2可能与NOR相互作用，调控番茄果实成熟。 ? 图1.番茄果实的成熟特性。A：番茄果实成熟表型；B-E：番茄果实成熟过程的乙烯产量、番茄红素含量、H2O2含量、蛋白质羰基含量；F：SlMsr和NOR基因表达谱。 ? 2???NOR是E4和SlMsrB2的靶蛋白 ? 酵母双杂交显示E4或SlMsrB2与NOR的共转化酵母细胞在培养基上生长良好（图2A），pull-down分析显示GST-E4或GST-SlMsrB2拉低His-NOR条带（图2B），说明它们存在物理相互作用。双分子荧光互补和免疫共沉淀分析表明NOR与E4或SlMsrB2在体内的互作（图2C-D）。 ? 凝胶阻滞分析表明添加E4和SlMsrB2可以有效地还原氧化后的NOR（图3A），LC-MS/MS分析显示NOR蛋白的8个甲硫氨酸残基中，Met-138、Met-192、Met-229、Met-293经过E4和SlMsrB2修复后氧化态显著下降，且E4似乎在Met-229和Met-293的还原中发挥重要作用（图3B）。提取p35S:NOR-GFP转基因果实的总蛋白，可鉴定出未氧化和氧化Met-138的NOR蛋白（图3C），说明番茄果实成熟过程中，活性氧诱导NOR蛋白的Met-138发生磺化氧化。 ? 图2.?NOR在体内或体外与E4或SlMsrB2的相互作用。A：酵母双杂交系统；B：pull-down分析；C：双分子荧光互补分析，黄色荧光为互作信号，蓝色荧光为叶绿素信号；D：免疫共沉淀分析。 图3?.E4和SlMsrB2调节NOR的氧化还原状态。A：氧化NOR的电泳迁移分析；B：E4和SlMsrB2降低NOR甲硫氨酸残基的氧化；C：NOR蛋白的质谱分析，含氧化Met-138的多肽红色标出。 ? 3???NOR氧化后降低其DNA结合能力和转录调控活性 ? 采用电泳迁移分析（EMSA）氧化NOR的DNA结合活性，结果显示His-NOR与NAM/ATAF1/2/CUC2核心基序紧密结合，导致条带向上移动，而His-NOR的氧化修饰显著降低NOR的DNA结合能力（图4A）。NOR蛋白含8个甲硫氨酸残基，其中Met-138位于保守基序中。说明Met-138氧化可能在调控NOR功能起重要作用。对Met-138进行定点突变，会降低NOR的DNA结合活性（图4B）。双荧光素酶检测显示pBD-NOR的表达显著提高LUC报告基因表达，而Met-138的突变显著降低LUC基因表达（图4C）。序列分析显示该保守基序在不同植物的NAC基因中保守，包括拟南芥A