毛细管电泳法.pptVIP

;;;;;;2 电泳和电渗 ;电渗 与固液界面的双电层有着密切的关系 在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁的负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动，携带着溶剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流（electroosmotic flow , EOF）。 ;固液两相间的总电势-热力学电势-φ0 ;电渗流的流型特点 电渗流 HPLC 塞流 层流 ;电渗流的表示 电渗流的大小可用淌度(μeo)或电渗流系数表示 μeo =υeo / E = l /( teo??E ) 电渗流速度 毛细管有效长度 电渗流流出时间 电场强度 ;电渗流的意义 电泳过程中，伴随着电渗现象 电渗流的速度比电泳速度快5－7倍 利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析 电渗流是毛细管电泳分离的重要参数 控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离度。 ;改变电渗流的方法 改变外加径向电场 改变缓冲液成分和浓度 Zeta电势 改变缓冲液pH 加入添加剂 改变温度 粘度 ;表观电泳淌度 μap;3 分离效率和分离度 ;分离度 电泳中两峰的分离度（Rs），也称为分辨率，它表示了淌度相近的组分分开的能力，可表达为 Rs= （n 1/2/4）×（ Δυ /υ平 ） Δυ相邻两区带的迁移速度差 υ平为两者的平均速度 Δυ / υ平表示分离选择性 n为柱效;分离度计算式 Rs = 2 (tm2 - tm1 ) / ( W1 + W2 ) tm1、tm2 分别为两个组份的迁移时间 W 为峰底的宽度? ;4 区带宽度及其展宽因素 ;区带宽度展宽因素 焦耳热 进样 电泳扩散 毛细管壁对组分的吸附 ;焦耳热 细内径（100μm），粗外径的毛细管柱 ;进样 试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。 细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。 一般进样区带控制在柱长的1% 电泳扩散 试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。 μs---μb ;毛细管壁对组分的吸附 电泳峰拖尾或变形，甚至消失。 抑制吸附作用常用的方法有： ●使用极端pH条件 ●加入中性盐或两性离子化合物 ●对毛细管内壁进行涂层处理 需要注意：方法也会抑制或改变电渗流 ;二 分离模式;1 毛细管区带电泳;2 胶束电动色谱;胶束电动色谱的应用特点: 使毛细管电泳不仅能分离离子化合物，而且还能分离中性化合物. 比高效液相色谱更为高效. HPLC 分离柱效为5000－25000理论板数/m MEKC 可达到50000－500000理论板数/m 比高效液相色谱更为高速.MEKC分离时间通常小于30min，但达到相仿效率的毛细管LC，需要更长的时间。 ;3 毛细管凝胶电泳;毛细管凝胶电泳综合了电泳技术和平板凝胶电泳的优点 : 电泳峰尖锐，柱效极高 短柱上实现极好的分离 试样容量为10－12g 主要缺点:制备柱较困难，寿命较短 已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核 酸、DNA等强有力的工具。例应用CGE分离与激光诱导荧光检测相结合，用于DNA序列快速分析。 ;4 毛细管等速电泳;;注意: 前导电解质的电泳淌度应高于试样中各组分的电泳淌度，而终结电解质的电泳淌度则反之。 电泳过程中被分离各组分的浓度都将接近前导电解质浓度，对痕量组分在柱上浓缩可达几个数量级，成为重要的柱上浓缩技术之一。 ;5 毛细管等电聚焦;方法: 进样－等电聚焦－检测 先将脱盐的试样（蛋白质）以≥1％的浓度与两性电解质溶液混合，用压力进样充入毛细管柱(阳极端)，置于阳极电解质溶液如H3PO4中，检测端为阴极端，置于阴极电解质如NaOH中。 施加电压，进行电泳实验。两性电解质离子形成pH的位置梯度，而蛋白质在迁移时会在其等电点的pH区域内停止移动。这样pI不同的蛋白质各组分会在毛细管内很窄的不同pH区域内聚焦.