多聚酶链式反应扩增dna片段-总结.ppt

三、 PCR 的实验操作 1 、 PCR 仪 （一）设备及用具 实质上一台能够 自动调控温度 的仪器 2 、微量离心管 一种 薄壁塑料管 ，总容积为 0.5ml 3 、微量移液器 用于 定量转移 PCR 配方中的 液体， 其上 的一次性吸液枪头用一次更换一次 PCR 仪 微量离心管 微量移液器 多聚酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR 技术 ) ，是一种在体外快速扩 增特定基因或 DNA 序列的方法，故又称为 DNA 体外扩增技术 。 温故知新 1: 组成 DNA 分子的 基本单位 是什么 ? 这些基本单位是如何连接成 DNA 分子的 ? DNA 分子结构有什么特点？ 1 2 3 4 5 DNA 的基本单位－ 脱氧核苷酸 O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱基 脱氧核糖 5 3 脱氧核苷酸链结构简图 磷酸二酯键 A T G C A G C T DNA 分子的平面结构 氢键 5 端 3 端 5 端 3 端 DNA 分子的复制过程是怎样的？ DNA 分子的复制需要哪些条件？ 温故知新 2 DNA 母链： 提供复制的模板 解旋酶： 打开 DNA 双链 4 种脱氧核苷酸： 合成子链的原料 DNA 聚合酶： 催化合成 DNA 子链 ATP ： 为复制过程提供能量 引物： 使 DNA 聚合酶从引物的 3 ′ 端开始 连接脱氧核苷酸 DNA 复制的条件 复制特点 半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。 DNA 复制的方向 DNA 的合成方向总是从子链的 5 端向 3 端延伸 1 、 DNA 聚合酶特性 不能从头合成 DNA ，只能从 DNA 的3′端开始延伸 DNA 链， 因此， DNA 复制需要引物 2 、 DNA 聚合酶作用过程 当引物与 DNA 母链通过碱基互补配对结合后， DNA 聚 合酶就能从引物的3′端开始延伸 DNA 链， DNA 的合成 方向总是从子链的5′端向3′端延伸 一、基础知识 （一） PCR 原理： ①在 80 ～ 100 ℃的温度范围内， DNA 的双螺旋结构将解体， 双链分开，这个过程称为变性 3 、 PCR 原理 ②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的 DNA 链又会重新 结合成双链 ③ PCR 利用了 DNA 的热变性原理，通过控制温度来控制双 链的解聚与结合，现在使用的 PCR 仪实质上也是一台能够 自动调控温度的仪器 高温解决了打开双链的问题，但是，又导致 DNA 聚合酶 失活的问题，耐高温的 Taq DNA 聚合酶解决了高温导致 DNA 聚合酶失活的问题，促成了 PCR 技术的自动化 4 、 Taq DNA 聚合酶的应用 5 、 缓冲液需要为 PCR 反应提供的物质 DNA 模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种 脱氧核苷酸，耐热的 DNA 聚合酶，同时通过控制温度使 DNA 复制在体外反复进行 PCR 技术是 80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性 好、易自动化等突出 6 、 PCR 技术的特点 ① PCR 过程需要的引物是 RNA 或 DNA ，而是人工合成的 DNA 单链，其长度通常为 20 － 30 个脱氧核苷酸 7 、细胞内复制和 PCR 不同点 ② PCR 过程中 DNA 的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反 应温度的控制来实现的 细胞内 DNA 的复制 PCR 不 同 点 解旋 解旋酶，边解旋边复制 80 ～100℃高温解旋，双链完全分 开 酶 DNA 解旋酶， DNA 聚合酶， DNA 连 接酶 Taq DNA 聚合酶 引物 RNA DNA 或 RNA 能量 ATP 不加 温度 体内温和条件 高温 子链 合成 一条链连续（先导链），另一条 链不连续，先合成片段，再由 DNA 连接酶连接（滞后链） 两条子链均连续合成 相 同 点 ①需要提供 DNA 复制模板 ②四种脱氧核苷酸作为原料 ③子链延伸的方向都是从 5 端到 3 端 细胞内 DNA 的复制与 PCR 的比较 PCR 技术的原理总结 利用 DNA 分子的 热变性 原理，通过控制温度来控制双 链的