干扰载体构建SOP[汇编].pdfVIP

shRNA 干扰载体构建SOP 目录 第一部分 RNA 干扰原理及shRNA 设计 4 第二部分 酶切与回收 7 第三部分 退火与连接 9 第四部分 转化与涂平板 11 第五部分 挑菌与菌液PCR 13 第六部分 质粒提取 15 第一部分 RNA 干扰原理及shRNA 设计 标准操作规程(SOP) 1. 目的： 了解RNA 干扰原理，设计shRNA 干扰序列 2. 仪器与设备： 需要能够连接Internet 的个人计算机，引物设计相关软件(如Primer Premier 5) 。 3. 操作步骤 3.1 RNA 干扰原理 1) RNAi 概述： RNA 干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双 链RNA （double-stranded RNA，dsRNA ）诱发的、同源mRNA 高效特异性降解的现象。 简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA 诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内 源性mRNA 编码区同源的双链RNA 时，该mRNA 发生降解而导致基因表达沉默，是一 种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing) 。由于RNAi 具有高度的 序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或 基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi 技术 可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。 2) RNAi 原理：RNA 干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps) 。在起始阶 段，小分子RNA 被切割为21-23 核苷酸长的小分子干扰RNA 片段(small interfering RNAs, siRNAs) 。证据表明；一个称为Dicer 的酶，是RNase III 家族中特异识别双链RNA 的一 员，它能以一种ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方 式引入的双链RNA，形成19-21bp 的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2 个碱基 突出。在RNAi 效应阶段，siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA 诱导沉默 复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC 需要一个ATP 依赖的将小分 子RNA 解双链的过程。激活的RISC 通过碱基配对定位到同源mRNA 转录体上，并在距 离siRNA 3’端12 个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个 RISC 都包含一个siRNA 和一个不同于Dicer 的RNA 酶。 3) RNAi 示意图(见图1) 3.2 shRNA 设计 1) shRNA: 即short hairpin RNA(短发卡RNA) ，包含两个短反向重复序列(其中一个与目的 基因互补)，中间由一个loop 序列分隔，组成发夹结构。shRNA 在体内可以被加工成 siRNA 从而降解目的基因.。示意图见图2 。 2) shRNA 作用原理：见图3 。 3) shRNA 设计原则：  克隆到shRNA 表达载体中的shRNA 包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop) 序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后在连上5-6 个T 作为RNA 聚合酶Ⅲ的转录终止子；  两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点；  StrataGENE 发现29 个寡核苷酸较之原先推荐的23 个寡核苷酸可以更有效的抑制 目的基因；  在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以 确保转录的发生；  shRNA 目的序列的第一个碱基必须是G 以确保RNA 聚合酶转录。如果选择的目的 序列不以G 开头，必须在紧连正义链的上游加一个G ；  ShRNA 插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎 环都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有 s