生物化学与分子生物学实验：实验八-大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化.pptVIP

White Clover * * 实验八 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化 * * 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料 四、实验步骤 五、注意事项 讲授内容 实验内容 * *  学习和掌握大肠杆菌感受态细胞制备的原理和方法 了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 学习和掌握质粒转化的方法 一、实验目的 实验目的 * * 二、实验原理 2.1 基因工程（Genetic engineering） 又称DNA重组技术，在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。 2.2 感受态细胞(competent cells) 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA的分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 实验原理 * * 2.3 CaCl2法制备感受态细胞 CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法使用更广泛。 * * 2.4 CaCl2法制备感受态细胞原理： 细菌处于 0℃，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收 DNA 复合物。 钙离子的作用是结合于细胞膜上，是细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，使外源DNA进入。 实验原理 * * 2.5 质粒(plasmid) 为小型环状双链DNA分子，在细菌体内能独立复制、转录，拥有启动子，编码区和终止子；由于环状结构，质粒进入菌体内不易被DNA外切酶降解，从而保证了它在非同种细胞间的转移，作为基因的载体，在基因工程中有用。 实验原理 质粒特点： 1. 自我复制系统 2. 限制酶切位点 3. 抗性标记基因 * * 2.6 转化（transformation） 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株（R-M-）。 实验原理 * * 2.7 转化的方法： 化学方法(热击法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲将载体DNA分子导入受体细胞。 2.8 克隆的抗性筛选： 常用的抗生素有：氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、氯霉素、四环素、链霉素等。 实验原理 * * 重组DNA转化 细菌过程示意图 实验原理 * * 三、实验材料 实验器材： 冷冻离心机、水浴锅、恒温摇床、移液枪、酒精灯、计时器以及EP管、 15ml离心管、枪头、涂布棒、培养皿等。 试 剂 大肠杆菌DH5α、EGFP-N3重组质粒 、LB液体培养基、50 mg/ml卡那霉素、LB固体培养基、0.1mol/l CaCl2溶液 实验材料 * * 四、实验步骤 4.1 受体菌的培养 将DH5?细菌接种在LB平板上，37 oC培养过夜。 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37 oC下振荡培养12小时左右。 将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37 oC振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右（进入对数生长期）。 实验步骤 * * 4.2 感受态细胞的制备（CaCl2法） 将菌液（10 ml）转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4 oC下3000 g离心5分钟。 弃去上清，用预冷的0.1 mol/L的CaCl2 溶液1.5 ml轻轻悬浮细胞，转移至1.5ml的EP管中。冰上放置15分钟后，4 oC下3000 g离心5分钟。 弃去上清，加入0.5ml预冷0.1mol/l的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置5分钟，即成感受态细胞悬液。 感受态细胞分装成200 μl的小份，贮存于-70 oC可保存半年。（本次不分装，放冰上，下一步取20 μL用 ） 实验步骤 4.3 倒板： 移液枪调至12ul，从助教老师取三管融化的、含1.5%琼脂的培养基（小心烫手）。 将Kan迅速加入培养基中（不低于60 度，稍烫手），每管加入12u