生物化学与分子生物学实验：土豆酪氨酸酶的纯化及活性测定.pptxVIP

酶活力 enzyme activity ---- 指酶催化某一化学反应的能力 ---- 反应速率愈大，活力愈高 反应速率愈小，活力愈低 酶的活性 在优化的条件下（pH、离子强度、温度），1 min内转化1 μmol底物所需要的酶量。可用底物消耗量或产物生成量进行计算： α = (ΔA/ε·t)·V ·106;酶的比活力 在特定条件下，单位重量（mg）酶所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg 酶表示。;如何获得好的实验结果 低温操作：实验全程冰上操作，包括酶活力测定的配制样品期间等（注意垂直放置离心管并保证酶液完全浸入）；避免体温接触；长期储存于-80 oC。 精确控制反应时间，L-DOPA避光冷藏 刮取出来的粗酶应尽量完全溶解（用缓冲液多次冲洗玻棒头及移液枪吹打、涡旋）;; 层析法又称为色层分析法或色谱法，该法是基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析。 物理、化学及生物学特性指的是样品的溶解度、吸附能力、立体化学特性、分子大小、带电情况及能发生特异生物学反应等特点。;按层析原理分类;凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、去除小分子杂质、取出热源物质、样品浓缩等。;;酶标仪实际上就是一台变相的专用光电比色计或分光光度计，其基本工作原理与主要结构和光电比色计基本相同。 盛装待测比色液的容器不再使用比色皿，而是使用塑料微孔板（96/384 -孔板，酶标板）。微孔板常用透明的聚乙烯材料制成，对抗原抗体有较强的吸附作用，故用它作为固相载体。 由于盛样本的塑料微孔板是多排多孔的，光线只能垂直穿过，因此酶标仪的光束都是垂直通过待测溶液和微孔板的，光束既可是从上到下，也可以是从下到上穿过比色液。;粗酶样品;（1）装柱（视频演示） （2）样品制备：上次实验得到的两管粗酶，分别用2 ml pH7.0的PBS缓冲液溶解，12000 rpm, 2min两次离心取上清。 （3）其中一管全部上样于凝胶层析柱中。（操作演示） （4）洗脱与收集：每20滴收集一管（记录上样体积），收集20管 （5）各收集组份酶活力测定：各取收集管中溶液100 μL按顺序加入酶标板中，收集结束后由助教统一加入100 μL的 L-DOPA，37oC放置3 min（自行计时），于酶标仪中记录480nm处光吸收值。以洗脱体积为横坐标，吸光度为纵坐标，作洗脱曲线。 （6）将有酶活性的组份合并即为纯酶。;（7）按照下表往12联管中加入试剂，在37oC烘箱内反应3 min，在480 nm处测吸光度，（注意精确计时！）作标准曲线，拟合后在线性范围内的任意点取点，分别求粗酶及纯化酶的活力和比活力。比较纯化过程中酶活力/比活力的变化情况。 （8） 取500 μL与2500 μL的考马斯亮蓝G-250溶液混合后测蛋白质含量（Bradford法）