生物化学与分子生物学实验：实验十 聚合酶链式反应（PCR）及酶切鉴定转化产物.pptVIP

4.3 配制1%琼脂糖凝胶： 称取0.3 mg琼脂糖粉末，与30ml 1×TAE混合后，微波炉中加热溶解，待冷却至60度左右时加入2.5 μL的Gold View染色（5 μl/100 ml）轻轻摇匀，倒入洁净的模具中制胶。室温静置半小时左右，待凝胶完全凝固后拔出梳子，并将胶块放入倒满1×TAE的电泳槽中准备电泳。 4.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定： 取出PCR及酶切反应管，取20μl产物加入10×上样缓冲液2μL中混匀（蓝色），同时以DNA分子量标准为对照，分别上样后90V电泳30 min，用凝胶成像仪照相，与DNA分子量标准对照分析，在相当于产物大小的位置应出现荧光条带。 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围 琼脂糖浓度（％，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（kb) 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 五、注意事项 PCR非常灵敏, 操作应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。 PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。 六、实验思考题 降低或提高退火温度对PCR反应是否有影响？为什么？ 循环次数是否越多越好？为什么？ 酶切反应中，“星号活性”代表什么意思？如何避免产生“星号活性”？ 请简述葡聚糖凝胶层析和琼脂糖凝胶电泳分离蛋白质原理的异同 DNA Marker (ladder) 　 4.1 PCR扩增 在0.2 ml PCR管中加入各成分（表格） 混匀后短暂离心 将离心管置于PCR仪中，盖上盖子。 设定热循环参数（已设好） 进行扩增反应（约1.5小时） 每人有2管，一管是含有质粒为模板，另一管是无菌水做模板 4.2 限制性内切酶酶切： 1.5ml管中加入各试剂（表格），混匀低速离心，避免液体挂壁； 37oC 水浴10min； 直接加入loading buffer 终止酶切反应； 酶切产物留待PCR 反应结束后一起进行琼脂糖电泳检测 每人有3管，一管是质粒双酶切，一管是质粒单酶切 最后上样共5管样品+2个DNA marker， 共7个孔 4.2 限制性内切酶酶切： 在实际实验中，为避免超微量操作，通常采用预混部分试剂再最后混匀的方式进行加样，预混试剂已提前备好 混匀，低速离心，避免残留液体挂壁； 37oC 水浴10min； 直接加入loading buffer 终止酶切反应； 酶切产物留待PCR 反应结束后一起进行琼脂糖电泳检测。 * Most researchers are well versed in the performance of PCR. However, I usually emphasize that the performance of Real-Time PCR requires an emphasis on each step. STEPS 1) Prepare the Master Mixture and add all components to the reaction tube. 2) Denature the Template to generate single-stranded DNA. Usually performed at 95 oC for 30 to 60 s. 3) Annealing temperature. The temperature is lowered in order to promote the binding of the primers to its complimentary target. Generally ranges between 50 and 65 oC. * Starts with a Picture of the Annealed Template. 4) Extension Step - Between 65 and 72 oC. In many cas