细鳞鱼三种细菌的快速检测方法的建立.pdfVIP

摘要 细鳞鱼(Brachymystax lenok)属鲑形目 （Salmoniformes），鲑形科 （Salmonidae），鲑亚科 （Salmoninae），细鳞鱼属 （Brachymystax），近年来野生细鳞鱼分布范围逐渐缩小，野生种群急剧 衰退，为了阻止该种群灭绝，对细鳞鱼保护和驯养显得尤为重要，在细鳞鱼驯养繁育中发现细鳞鱼 会出现厌食、独居、水中打转、体表溃疡和肝肾脏出血症状，从患病鱼肝、肾、肠液和鳃中分离出 三种细菌，它们分别是温和气单胞菌（Aeromonassobria,AS）、迟钝爱德华菌（Edwardsiella tarda,Et） 和嗜水气单胞菌 （Aeromonas hydrophila,AH）。迫切需要一种快捷、简便方法对病原菌进行准确、 快速诊断，用于疫病早期预防和治疗。 目的：建立一种快速检测三种菌的方法，及时早发现细鳞鱼感染的这三种细菌，阻止细鳞鱼疫 情暴发和大规模蔓延，为细鳞鱼驯化带来保障。 方法：本试验取患病鱼的肝、肾、肠积液或者腮丝经过一系列的分离纯化得到了三种菌株，使 用四种鉴别培养基，根据在培养基上的形态特征初步确定菌株种类，并用20余种抗生素进行药敏实 验，使用 16S rRNA 来对分离纯化后的菌进行测序。利用环介导恒温扩增技术 （Loop-mediated isothermal amplification ，LAMP）建立嗜水气单胞菌、迟钝爱德华菌、温和气单胞菌的快速检测方 法。针对嗜单胞菌pilin 基因、迟钝爱德华菌ethA 基因、温和气单胞菌的zipA 基因设计特异性LAMP 引物。每种菌设计五套引物进行优化筛选，反应体系是25μL，其中环引物浓度为40pmol，内引物 浓度为40pmol，外引物反应浓度为5pmol，缓冲液浓度为2.5mol/L，镁离子浓度为150mmol/L， dNTP 浓度为10mmol/L，聚合酶浓度为8U，模板为2μL，补加去离子水至25 μL，在61-65℃之间 设定温度梯度，优化出最佳的反应温度，在该恒温条件下进行LAMP 扩增，进而优化出最佳镁离子、 缓冲液、引物比例和dNTP 的量，采用琼脂糖电泳和核酸染料颜色法对扩增结果进行比较判定。将 -11 -2 模板DNA 进行10倍倍比稀释以后，分别用10 至10 倍比稀释的DNA 为模板来检测其灵敏性； 提取杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌的基因组DNA 作为模版，用上述优化体系进行反 应，观察有无白色沉淀，加入染料后有无颜色变化和梯形条带，检验建立的方法特异性；将建立的 LAMP 方法与传统鉴定方法和实时荧光定量方法比较，检测所建立LAMP 方法的准确性。 结果：建立的LAMP 快速检测方法中每种菌筛选出一套最佳引物，最佳反应体系是环引物浓度 为40pmol，内引物浓度为30pmol，外引物反应浓度为5pmol，缓冲液浓度为2.5mol/L，镁离子浓 度为150mmol/L，dNTP 浓度为10mmol/L，聚合酶浓度为8U，模板为2 μL，60min 内观察结果。 -10 -9 嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和迟钝爱德华菌的最低检出浓度分别是6.35×10 、1.663×10 、9.86 -10 ×10 ng/μL，该方法特异性好、灵敏度高，可将病源检测时间控制在 1天以内，传统检测方法所需 -11 时间至少两天，实时荧光定量PCR 能够扩增浓度为10 ng/μL 基因组DNA，但所需加样环境有较 高要求，不适宜在基层推广。 结论：该方法所需仪器简单、准确高效、操作方便、适宜在临床、生产上推广使用。 关键词：细鳞鱼；嗜水气单胞菌；温和气单胞菌；迟钝爱德华氏菌；LAMP I Abstract TheBrachymystax lenokbelongstothe genusSalicidae,andthe distribution ofwild squidin thegenus Dipt