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自杀质粒法 构建基因缺失株 指导教师：李槿年 教授 学 生：王 薇 目 录 一、自杀质粒方法原理简介 一、自杀质粒方法原理简介 1.同源臂扩增 2.DNA片段和载体的酶切与连接 三、接合转移 单交换 双交换 野生型 四、双交换的筛选及鉴定 * LOGO LOGO 自杀质粒方法原理简介 1 重组质粒的构建 2 接合转移 3 双交换的筛选及鉴定 4 自杀质粒：通常为R质粒的衍生质粒，具有接合转移基因。它的复制需要一种特殊的蛋白，大多数细菌不产生这种蛋白质，因此，当进入寄主细胞时，要么不能复制，被消除，要么被整合入染色体上，和染色体一起复制。利用自杀质粒的这个特点，将基因工程技术构建的基因缺失的DNA片断，克隆入自杀质粒，利用缺失基因两端的同源片断，定位自杀质粒的整合位点。利用同源性DNA片断可发生重组的原理，构建精确基因缺失菌株。 上下游同源臂 sacB cat 接合 DNA片段和载体的酶切与连接 重组质粒 同源臂扩增 二、重组质粒的构建 NCBI上BLAST要敲除的基因 出现很多菌株的同源序列 截取待敲除基因两侧的基因片段各500bp左右分别进行序列比对 以序列比对后同源性较高的一段序列为模板，进行引物设计 PstⅠ SacⅠ 外源DNA插入 酶切 载体 重组 外源DNA片段（上下游同源臂） PstⅠ SacⅠ 通过化转，导入宿主细胞 E.Coli S17-1 抗性筛选 Sm、Cm E.Coli S17-1 HX4 种子液 转摇 对数期 1:1混合 4℃，3000g/min离心3~5min 沉淀用LB洗涤两次，再用100μL 重悬 弃上清 Km、Cm 30℃，5~8h 用1mL LB洗菌，涂布双抗平板 30℃ 接合后，自杀质粒被导入HX4中，由于不能自主复制，所以质粒靠同源臂与HX4基因组发生以下三种方式的同源重组 野生型 双交换 单交换 四、双交换的筛选及鉴定 SacB Cat F1 F2 F1 F2 SacB Cat SacBS 、CmR F2 Cm F1 SacB Cat F1 A F2 SacB Cat F1 Cm F2 F1 A F2 F1 Cm F2 SacBR 、CmR SacB Cat F1 Cm F2 F1 A F2 F2 Cm F1 F1 A F2 SacB Cat F1 A F2 SacBR 、CmS 挑取在双抗平板上长出的接合子单菌落 接种于不含抗生素的平板上 四区划线于含Cm的25%蔗糖培养基中，26~28℃培养 PCR鉴定，用各自引物分别扩增Cm及OmpU基因 * LOGO
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