荧光定量PCR技术的讲座_理论基础、引物和探针设计、体系优化、实验方案、数据分析、污染防控.pptVIP

二、引物及Taqman探针的设计 2、Taqman探针及引物的设计原则： （1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异； （2）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显 子； （3）、引物TM值为60℃左右，探针的TM值为70℃左右； （4）、探针的5’端应避免使用鸟嘌呤G，因为5’G会有淬灭作用，而且即使 是被切割下来还会存在淬灭作用； （5）、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量 G含量高会降低反应 效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针； （6）、引物之间的TM相差避免超过2℃； （7）、典型的引物长度为18-24bp，探针长度为15-45bp； （8）、PCR产物长度在50-150bp之间，这样有利于使PCR效率相同； （9）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其 特异性 二、引物及Taqman探针的设计 2、Taqman探针及引物的设计原则： 探针中GC含量的差异对定量PCR反应效率的影响 二、引物及Taqman探针的设计 3、Taqman探针及引物的设计举例 1 ATGAACTACG TTGGACAGTT AGCAGGGCAA GTGTTTGTAA CTGTGAAGGA GCTCTATAAG 61 GGACTAAACC CAGCCACGCT GTCGGGATGT ATCGATATAA TTGTTGTACG TCAGCCAGAT 121 GGGAATCTTC AGTGTTCTCC ATTCCATGTA CGCTTTGGGA AAATGGGAGT TCTGCGTTCC 181 AGGGAGAAAG TGGTTGACAT AGAAATTAAT GGAGAGGCTG TAGATTTGCA CATGAAGCTA 241 GGAGACAATG GAGAAGCCTT TTTCGTCCAG GAGATGGATA ACAATCAGGA GGTAATTCCT 301 TATCATCTGT CTACGTCCCC CATCCTGTCT GAGGGAACTG CGTTAATGGA AGCTCAGCTG 361 AAGAGAAACT CAATTGACAG GATAAGAAAC CTGGACAGCA GTGTATCTTC ACAAGTACCA 421 CCCCAAGCTC ATGGATCCCA GCCTGGTACT GAAACATCTC CAGCCTGTAG CTCTGTGAAA 481 AAGAGGAGGA AAAAGAGGAG GAAGTCTACC CACAAAATAG ACAGCTTAAA AAGAGAAGAC 541 ATTGGAGATA CATCAGAAGA TGAAGACATG TTTCCTATAG AGATTAGCTC AGAGGAAGAA 601 AAGGAACAAT TGGACAATTC AAGGATTCTT GTTCCAGATG TGTTTGTTGA TGAAGTATCT 661 GATATAAAGG CTCCTGCTGT TTCTGCTTAT TCTCAGTCTT CATCTTACCC TCGTTCGGAT 721 GGAGAATGGT CACCCATTCA AAGTAAGCCC ATAGATTACA CAGGGCAATC CTCTCTTCTC 经Oligo软件验证，探针TM值70℃左右，上下游引物的TM值都为60 ℃左右，二级结构 分析，引物和探针比较理想，再经BLAST分析，引物和探针特异性较好。 二、引物及Taqman探针的设计 4、Taqman探针及引物合成时注意事项 （1）、引物及探针设计好之后，委托一家放心的合成公司合成； （2）、先不要急于合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通 PCR，电泳检测PCR产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特异 性扩增情况，必要时进行PCR产物的测序验证； （3）、确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能避免很多以 外的损失； （4）、探针合成好后，先检测一下探针的质量，250nm的探针终浓度， 25ul水，反应体系中只有水和探针，在荧光定量PCR仪上检测， 95℃，2min; 95℃，20s，60℃，20s，40个cycles；看荧光本底和 荧光强度的变化情况，好的探针荧光本底较低，随着PCR反应，荧 光强度不会变化，假如荧光强度变化的比较大，说明探针合成质量 较差，建议重新合成。 三、内参基因的选择 1、理想的内参基因具有的特点 （1）、不存