大肠杆菌转化实验(热击法).docVIP

大肠杆菌转化实验（热击法） 大肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。 1原理： 质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。 2器材： 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。 3材料和试剂： 质粒DNA，重组DNA，培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。 4实验准备： 无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。 5操作步骤： （1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。 （2）从-70℃ 超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。 （3） 加入10μl连接产物（一般是全部连接产物）（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。 （4） 轻轻摇匀后插入42℃水浴中90秒进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。 （5） 在超净工作台中向上述各管中分别加入900μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡30min到50min （6） 在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。 （7） 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。 （8） 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。 （9） 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。 （10）观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。