实验八酶免疫技术.pptVIP

实验六 酶免疫技术 实验目的 掌握ELISA试验的原理、方法、操作步骤 实验内容 静脉采血 ELISA法检测乙肝标志物 酶标记免疫技术又称酶免疫技术： 抗原抗体反应的特异性 酶促反应的专一性 基本原理： Ab+E Ab-E+Ag AgAb-E+底物 显色 Ag+E Ag-E+Ab AgAb-E+底物 显色 该实验可对标本中抗原（抗体）进行定性、定位和定量分析。 酶免疫技术分类 ELISA法检测乙肝标志物 一、原理： 双抗体夹心法 双抗原夹心法 竞争法 二、试剂 有五种试剂盒，对应五种HBV标志物 1、酶联反应板，聚苯乙烯固相载体，已包被妥已知抗原或抗体。 2、酶标记物：HRP标记的已知抗体或抗原。 3、显色剂：分A、B两种，分别是MTB和H2O2。为HRP作用的底物。 4、对照品：阳性对照血清、阴性对照血清、质控血清。 5、其他试剂：如竞争法的标准抗原或抗体等。 6、终止液：0.2M的硫酸溶液。 7、洗涤剂：一般为PB加非离子型表面活性剂。 双抗体夹心法基本操作 1、固相载体：聚苯乙烯塑料 2、包被：取已知抗体加入空白反应板中，置冰箱过夜，次日甩干，洗涤后备用。此为已包被好的反应板。 3、加样：取待测样品50μL，加入反应孔内。 4、加酶标记物：取酶标记物50μL，加入反应孔内。 5、水浴：37度水箱30min。 6、洗涤：每孔加满洗涤液，静置15秒，甩出后拍干，连续5次。 7、显色：加显色剂A、B液各一滴，水浴15min显色。 8、结果观察，肉眼观察可不加终止液，直接观察，如用酶标仪比色，需加终止液50μL于反应孔内，然后上酶标仪。 9、注意事项：不同厂家其操作过程各不相同，注意看说明书。如用酶标仪，要设置空白、阳性、阴性，然后计算。 操作步骤 1、每两人一组，操作时认真看说明书。 2、每组分别测定两个组员的标本、阴性对照、阳性对照、空白对照。 3、每组均要测定：HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe和抗HBc，共五项 4、如图所示排列好反应孔 5、设定测定孔、阴性对照、阳性对照、空白对照。 6、加样品、酶标记物。血清竖排加、试剂横着加。 7、水浴30分钟，甩干洗涤。每孔加满洗涤液，放置15秒，甩干后拍干，反复5次。 8、加显色液A、B每孔各一滴。水浴15分钟。 9、观察结果。 HBsAg、抗HBs、HBeAg ：阳性呈蓝色 阴性无色 抗HBe和抗HBc：阳性无色 阴性呈蓝色 临床意义 1．HBsAg：血清中检测到HBsAg，表示体内感染了HBV，因而是一种特异性标志。HBsAg阳性见于：①急性乙型肝炎的潜伏期或急性期（大多短期阳性）；②HBV致的慢性肝病、迁延性和慢性活动性肝炎、肝炎后肝硬化或原发性肝癌等。③无症状携带者。 2．抗HBs：表示曾感染过HBV，不论临床上有无肝炎症状表现，均已得到恢复，并且对HBV有一定的免疫力。 3．HBcAg与抗HBc：由于HBcAg主要存在于肝细胞核内，并仅存在于Dane颗粒中。因此，对病人血清不能检测HBcAg，而测抗HBc.血清内抗HBc阳性反映：①新近有过HBV感染；②体内有HBV增殖；③有助于诊断急性或慢性乙型肝炎，特别是少数病例就诊时已处于急性恢复期早期，HBsAg已从血中消失，此时血中仅有抗HBc存在，因此，对恢复期患者可作病因追索。 4．HBeAg和抗HBe：HBeAg的存在常表示病人血液有感染性。HBeAg阳性揭示病人肝脏可能有慢性损害，对预后判断有一定帮助。抗HBe阳性对病人可能有一定的保护力。 * 相结合的技术 敏感性高 特异性高 不需特殊备 酶免疫技术 酶免疫组化 酶免疫测定 均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 聚苯乙烯为固相载体其他固相载体——ELISA 琼脂糖珠为固相载体 双抗体夹心法测抗原 阳性 阴性 E E E E E E E E E 竞争法测抗原 阳性 阴性 E E E E E E E 2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合 3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱 3、加酶作用 的底物显色 1、已知抗体包 被于载体表面 1、已知抗体包 被于载体表面 2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合 E HBsAg 抗HBs HBeAg 抗HBe 抗HBc 标本一 标本二 阴性对照 阴性对照 空白对照 HBsAg 抗HBs HBeAg 抗HBe 抗HBc 大球形颗粒：亦称Dane颗粒 小形球颗粒 管形颗粒 *