空间排阻色谱.ppt

?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? * * ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? * * ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? * * ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? * * 仪器分析 供药学类、中药学类、制药工程及相关专业使用 全国普通高等中医药院校药学类专业“十三五”规划教材（第二轮规划教材） 第十二章经典液相色谱法（LC） 经典液相色谱法 LC 第四节 分子排阻色谱法 基本原理 凝胶类型 实验条件的选择 空间排阻色谱（凝胶色谱） 利用大小不同的分子在多孔固定相（凝胶）中的选择性渗透来分离。 适用于分离分子量不同的大分子物质（Mr 2000） 一、基本原理 1、分离机理 （1）前三种是亲和力不同而分离； （2）凝胶色谱中组分与固定相之间无作用力，只是根据分子量大小来分离； （3）凝胶 — 有一定的孔径分布范围的多孔物质。组分进入柱内后，全向固定相的孔中扩散，保留程度取决于孔和组分分子的大小。 小分子:将全部渗入细孔中,在流经柱时,经历的路程最长. 中等大小分子:渗入部分较大的孔隙,而被较小的孔隙排斥,经历的路程居中. 大分子:完全被排斥在空隙外,经历的路程最短. 所以洗脱次序仅是分子大小(分子量)的函数。 分子大小受分子量,分子几何形状（环球形、螺旋形或棒形）组分分子间的缔合程度、组分与流动相分子间的缔合程度有关。 Size Exclusion Chromatography 2、分配系数和保留值 (1) 分配系数K：组分进入柱子，从高浓度的流动相中向固定相孔隙内扩散，扩散平衡时 a、小分子平衡时，一半组分在孔隙内，一半组分在孔隙外。 CS=Cm K=1 b、大分子（直径大于固定相孔径时），被全部排斥在固定相孔隙之外 CS=0 K=0 c、中等大小分子，直径介于以上两种极限之间， 0K1 所以在凝胶色谱中 0≤K≤1 （2）保留值 保留方程 VR = Vm + KVS 在凝胶色谱中 Vm：外水体积（V0） VS：内水体积（Vi） 当 K = 1 时，VR ＝ Vm ＋ VS＝V0＋Vi K = 0 时，VR ＝ Vm ＝ V0 所以，所有组分均在 （Vi+V0） 体积内流出。 二、凝胶类型 1、葡聚糖凝胶 2、聚丙烯酰胺凝胶 3、琼脂糖凝胶 4、多孔玻璃凝胶 1～4 用于亲水性样品的分离 5、聚苯乙烯凝胶（非水溶液样品—亲脂性） 三、实验条件的选择 分子量较正曲线 将分子量不同的组分混合物注入柱子，经分离后，分别测得它们的保留体积，以分子量对保留体积作图，得一曲线，称分子量校正曲线。 图中，A、B两点反映了该固定相能够分离的组分分子量的上限(排斥极限)、下限(全渗透极限)，只有分子量在A、B对应量之间的组分才能被分离。 1、凝胶的选择 2、凝胶的溶胀、装柱： 干凝胶+10倍吸水量的洗脱剂中，缓慢搅拌； 注意：时间足够长，不易过稀。不应有气泡。 柱长100cm 3、样品的制备 组别分离（粗分）：上样量可以是柱体积的25～30%。 K值相近的物质（细分）：上样量可以是柱体积的2～5％。 4、洗脱：洗脱剂应与溶胀凝胶的溶剂相同。 洗脱剂：水、不同离子强度的溶液、不同pH的缓冲液、水一有机溶剂混合液。 5、应用：测定大分子物质的分子量（如Pr） ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? * * ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? * * ?????????????????????????????????