山东大学研究生国家课程_原核基因表达系统.pptVIP

基因工程过程示意图 基因工程的目的 ★ 克隆基因（获得大量DNA） ★ 表达目的蛋白,获得基因工程产品（原核表达系统和真核表达系统） ★ 研究基因的功能 基因的过表达（overexpression) 基因沉默(knock down) 基因敲除(knock out) ★ 基因治疗 第一节 概论 一．几个重要概念 1、表达系统（gene expression system)： 基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，可以完成基因的克隆、复制、转录和翻译，包括克隆载体、表达载体及受体细胞。 二．原核生物基因结构和表达特点 Gene structures and gene expression in prokaryotic cells 外源基因在原核细胞中的表达主要包括2个过程：转录和翻译 转录：遗传信息DNA RNA 翻译：mRNA 蛋白质 原核生物中参与转录的基因结构 转录：遗传信息DNA RNA 模板链：反义链或（-）链，dsDNA分子中被转录成RNA转录本的链 编码链：有义链或（+）链，以T代替U，与RNA转录本具有同样的序列 转录酶：依赖于DNA的RNA聚合酶 把转录起始点的碱基定为+1，5’端方向为“-”，3’端为“+” 启动子与终止子 原核生物基因表达特点 1. 仅一种RNA聚合酶，识别原核细胞启动子，催化所有RNA合成 2.原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA (naked DNA) ，其转录和翻译是偶联的连续进行。 在翻译过程中形成多核糖体，每个核糖体独立完成一条肽链的合成。 3. 原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。 多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）：即可作为两个或多个肽链翻译模板的mRNA 4、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统 5、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。 操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的若干基因组成的一个遗传单位 操纵子： 原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。 标准结构包括：调控区(调节基因，启动基因，操纵基因) ，位于上游 结构基因：3-12个蛋白质编码基因 转录终止子：位于下游 共同协调作用，结构基因被转录成一个多顺反子mRNA，再翻译成各自的蛋白质。 乳糖操纵子结构 Lac操纵子调控区有I基因、P基因和O基因， Lac I编码阻遏蛋白，结合于操纵（O）基因上，启动子（P）是转录起始时RNA酶的结合部位 Lac操纵子有3个结构基因：Z基因、Y基因和A基因，分别编码beta-半乳糖苷酶、渗透酶和乙酰化酶，参与乳糖的代谢。 Lac操纵子受分解代谢系统的正调控和阻遏蛋白的负调控 I基因编码的阻遏蛋白与操纵基因（O）结合，阻断转录； 诱导物与阻遏蛋白结合，操纵基因解除抑制，RNA聚合酶结合于启动子，基因转录； 转录产物为同时含有Z基因、Y基因和A基因的多顺反子mRNA 6.原核基因表达的调控 主要在转录水平； 有两种方式：启动子和终止子 终止子（terminator，T）:位于DNA链的3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的序列 特征： 富含G/C的区域和富含A/T区域相邻排列，具有回文对称结构，在RNA转录本上形成茎-环（stem-loop)结构。 不同的终止子的作用也有强弱之分。 包括与蛋白质因子无关的转录终止信号和依赖于蛋白质因子（ρ因子）的转录终止信号 一、影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素 对外源基因的要求 对原核表达载体的要求 （一） 外源基因的要求 1. 外源性基因的编码区必须是连续的，删除真核基因的内含子和5’非编码区原核：DNA 真核：cDNA （二）对载体的要求 有MCS 启动子：建立表达载体时，选择强启动子。 第三节 原核表达载体prokaryotic expression vector 原核表达载体：? 适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。 主要元件：强启动子 SD顺序 筛选标志 其它调控基因 （一）非融合型表达载体 (non-fusion vector) 非融合型表达载体----pPL-Lamda PL启动子---温度诱导 插入位点—HpaI 受CI基因负调控 位相载体----含有3种读码框的系列载体 3、优点： 表达