305-牛津杯法抑菌试验.docVIP

牛津杯法抑菌试验 1. 原理 将加有牛津杯的双层平板置于培养箱中培养，一方面试验菌（病原菌）开始生长繁殖，另一方面抑菌物质呈球面扩散，形成递减的梯度浓度。牛津杯周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈，抑菌圈的大小反映抑菌物质对指示菌的抑制程度。 2. 仪器、设备 2.1 超净工作台 2.2恒温培养箱：36±1℃。 2.3恒温水浴锅：50±1℃。 2.4高压灭菌锅。 2.5平皿：直径为9 cm。 2.6 移液器（20~200μL，100~1000μL，1~5mL）及配套无菌枪头。 2.7试管：15×150 mm。 2.8 酒精灯。 2.9试管架。 2.10涡旋混匀器。 2.11摇床：36±1℃。 2.12牛津杯。 3. 病原菌、培养基及其他 3.1病原菌：大肠杆菌：ATCC25922、沙门氏菌: ATCC14028、金黄色葡萄糖球菌：ATCC6538。 3.2 抑菌物质：益生菌（乳酸菌、芽孢菌）、抗生素或其它抑菌物质。 3.3 培养基： （1）大肠埃希菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。 （2）金黄色葡萄球菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。 （3）沙门氏菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。 （4）乳酸菌：MRS肉汤。 （5）芽孢菌：营养肉汤。 3.4 其它： 0.85%灭菌生理盐水，灭菌蒸馏水。 4 测定流程 4.1病原菌扩培： 在超净工作台内，挑取新鲜的斜面保藏病原菌1环，接种于100mL无菌的营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃，200rpm，培养16-20h。将培养好的病原菌菌悬液用空白营养肉汤培养基稀释10倍，若OD600在0.30-0.36之间， 则为有效病原菌菌悬液，此时病原菌菌悬液原液中病原菌含量约为109cfu /ml。 4.2 抑菌物质（抗生素或益生菌菌悬液）的制备： （1）抗生素：抗生素或其它药物用无菌水稀释至所需要的浓度。 （2）乳酸菌扩培： 无菌条件下称取相当于约10亿CFU量的乳酸菌菌粉（如果是包衣产品需要在称样前无菌条件下研磨释放乳酸菌），接种于100mLMRS液体培养基中，37℃静置培养24~48h即为扩培好的乳酸菌菌悬液。 （3）芽孢菌扩培：无菌条件下称取相当于约10亿CFU量的芽孢菌菌粉，接种于100mL 营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃，200rpm，培养14~18小时即为扩培好的芽孢菌菌悬液。 4.3双层平皿的制备： 取平皿分别倾注营养琼脂培养基15-18mL，使其在平板内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层，将平皿倒置平均划分区域并标记添加物。另取半固体营养琼脂培养基适量放冷至48?50 ℃，将4.1中病原菌菌悬液原液稀释至106cfu /mL左右，每4.5mL半固体营养琼脂培养基加入0.5mL，倒入每平皿中，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。放置在水平台上冷却后，在每1平皿中以划分好的区域等距离均匀安置牛津杯4个备用。 4.4 抑菌试验： 取4.2步骤中准备的抑菌物质，每个双层平皿中的牛津杯中分别滴装200μL，37℃静置培养16-20h后，测量各抑菌圈直径（或面积）以作出评价。选取典型平皿拍照片。 备注：①牛津杯的放置一定要平稳、到位，确保底部准确插到两层平皿之间；②抑菌物质添加时确保全部加到牛津杯内部，不要洒在牛津杯外壁或外部，如果洒在外面会形成乳酸菌或芽孢菌在抑菌圈的生长；③如果无法控制乳酸菌或芽孢菌在牛津杯外面的生长，可以将乳酸菌、芽孢菌菌悬液在无菌离心管中离心，取其上清加入牛津杯中做抑菌试验。 4.5 抑菌性能评价 抑菌性： 抑菌圈＜10mm为无抑菌作用，抑菌圈＞10mm＜15mm 的为中度抑菌，抑菌圈＞15mm的为高度抑菌。 备注：①抑菌圈越大说明抑菌效果越好；②抑菌圈是指圆形透明圈的整个直径；③牛津杯外径为8mm。