双向琼脂扩散试验.ppt

* 利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。 掌握双向琼脂扩散试验的原理 掌握抗体效价的测定方法及抗原抗体性质的分析方法 了解双向琼脂扩散实验的应用 沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在电解质存在的条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。 可溶性抗原 相应抗体 + 沉淀物 可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂糖凝胶板的对应孔中各自向四周自由扩散,若两者分子比例适当,则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线. 1．人血清。 2. 兔抗人 IgG 。 3．1%琼脂糖溶液。 4．其他：加样器、打孔器、湿盒、恒温箱等。 1．制备琼脂板：标记载玻片，置于水平台上，吸管吸取4.5ml 1%琼脂糖溶液均匀浇在载玻片上，注意勿产生气泡。 2. 打孔：待琼脂糖完全凝固后，将琼脂板置于图样上，用打孔器打孔（梅花孔中1周6，双排孔上下各6），孔间距为5mm。 3．加样：于中央孔加入10μl兔抗人IgG（Ab），周围孔依次加入生理盐水、倍比稀释的人血清（Ag），每孔10μl。 4．将琼脂板平放于湿盒内，置37℃温箱中24h，观察结果。 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 Ab 生理盐水孔为阴性对照，与中间孔空之间无沉淀线。 周围孔（1:10、1:20、1:40 、1:80、 1:160）的人血清）与中央孔（兔抗人IgG）之间是否可出现清晰的乳白色沉淀线。 Ab的效价以出现白色沉淀线的Ag的最高稀释度表示。 Ag Ab A B C D E F A: 浓度Ag、Ab及分子量近似； B：浓度Ag、Ab近似，分子量Ag ＜ Ab ； C：浓度Ag、Ab近似，分子量Ag ＞ Ab ； D：浓度Ag＞Ab，分子量近似； E：浓度Ag＞Ab，分子量Ag＜Ab ； F：浓度Ag＜Ab，分子量Ag＞Ab ； * 利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。