枯草芽孢杆菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶的分离纯化和部分性质-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

枯草芽孢杆菌6一磷酸葡萄糖脱氢酶的分离纯化和部分性质 枯草芽孢杆菌6一磷酸葡萄糖脱氢酶的分离纯化 和部分性质 专业：生物化学与分子生物学 作者：莫宏春 导师：刘克武 摘 要 枯草芽孢杆菌通过超声破壁、(NI-h)2S04分段盐析、DEAE—Sepharose FF 离子交换层析、Blue Sepharose CL．6B亲和层析、Sephadex G．200凝胶过滤等 纯化步骤，分离出6．磷酸葡萄糖脱氢酶((堪PD)。经PAGE和SDS．PAGE检 测为单一蛋白区带，比活力为1．7375IU／mg，纯化倍数为72．7，收率为13．6％。 凝胶过滤法测定该酶表观分子量约为220kD，SDS．PAGE测定亚基分子量约 为50．5kD，可见该酶是由四个相同亚基构成的四聚体。等电聚焦电泳测得等 电点为6_3，用动力学方法测得该酶的最适反应pH为8．5，最适反应温度为 37℃，以6．磷酸葡萄糖(G6P)为底物的Km值为0．177mmol／L。 考察了部分金属离子及EDTA对该酶活性和紫外、荧光光谱的影晌：Mg“ 起激活作用：zIl2+低浓度时表现激活作用，高浓度时表现抑制作用：A矿、Fe” 起抑制作用：而EDTA和Mn2+基本无影响。部分金属离子使G6PD的构象发 生改变，发色团所处的微环境随之发生变化，使紫外吸收峰变宽变平。A矿 和Fe2+引起色氨酸(Trp)残基的荧光淬灭；M92+和EDTA均使G6PD的荧光 强度增强，说明它们使Trp残基重新包裹在分子内部而处于疏水的微环境中； zn2+和Ma2+均使G6PD的荧光强度变小，说明它们使酶分子构象变褥疏松， 原来处在分子内部的发色团暴露在极性环境中。 天然G6PD的远紫外圆二色谱显示在208nm和222nm两处的双负峰曲 线，说明a一螺旋含量高，此时含有41．2％的d一螺旋，20．6％的13一折叠和38．2％ 的无规卷曲及其它构象单元。 用常见的荧光淬灭剂丙烯酰胺和Ⅺ研究G6PD分子中Trp残基的微环境， 发现它们对分子中Trp残基的荧光均有淬灭作用，丙烯酰胺能淬灭100％fl馈 发现它们对分子中Trp残基的荧光均有淬灭作用，丙烯酰胺能淬灭100％fl馈 光，KI能淬灭78％的荧光，表明分子中小部分Trp残基埋藏在分子内部，大 部分Trp残基处于分子表面的极性环境中。 关键词枯草芽孢杆菌；6．磷酸葡萄糖脱氢酶；分离纯化； 圆二色谱； 荧光光谱；荧光淬灭 2 Isolation，purification Isolation，purification and characterization of G6PD from j爻subtilis Major：Biochemistry and Molecular Biology Author：Hongchun Me Supervisor：Kewu Liu Abstract 61ucose 6-phosphate dehydrogenase(G6PD)was isolated and purifled from Bacillus subtiIis BF by a procedure including cell sonication、 salting out with (NI-h)2S04、 ion-exchange chromatographing with DEAE、Sepharose FF、affinity chromatOgraphing with Blue Sepharose CL-6B and gel filtration with Sephadex G一200．The purlfled G6PD showed a single protein band on PAGE and SDS—PAGE determination respectively． The purlfied enzyme had a specific activity of 1．7375IU／mg，a 72．7-fold purlfication was obtained with a recovery of 13．6％．The apparent molecular weight of G6PD，determined by gel fiitration，was 220KD： The subunit molecular weight was 50．5KD as determined by SDS—PAGE， suggesting that the native enzyme was a tetramer consisting of four identical subunits．The result of