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聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量的蛋白质，小于1kb的DNA片段和DNA序列。分析装载的样品容量大，可回收，DNA纯度高。在催化剂TEMED（N-N-N，- N，-四甲基乙二胺）和过硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N- N，-亚甲双丙烯酰胺的参与下，聚丙烯酰胺链与链之间交叉联结形成凝胶。 1.1 配制30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g N- N，-亚甲双丙烯酰胺 1g 加水至100ML，40 1.2 配制5×TBE缓冲液：TRIS碱 54克 硼酸 27.5克 EDTA 3.72克 加水至1L 1.3 制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂体积 试剂 制备不同浓度（%）凝胶所用试剂体积（ml） 3.5 5.0 8.0 12.0 20.0 30%丙烯酰胺 11.6 16.6 26.6 40.0 66.6 水 67.7 62.7 52.7 39.3 12.7 5×TBE 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 10%过硫酸铵 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 1.4 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中有效分离范围 丙烯酰胺（%） 有效分离范围（bp） 二甲苯氰FF 溴酚蓝 3.5 1000-2000 460 100 5.0 80-500 260 65 8.0 60-400 160 45 12.0 40-200 70 20 15.0 25-150 60 15 20.0 6-100 45 12 聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤 2.1从NaOH池中捞出浸泡的玻璃板，取出上面的残胶 2.2 把玻璃板拿到流动水处洗刷干净 2.3 洗干净的玻璃板至于玻璃板架上晾干 2.4 用乙醇擦洗玻璃板 2.5 带凹口的背板涂上硅化剂，面板则涂上粘合剂，防止电泳完毕发生撕胶和脱胶的可能（涂摸要均匀） 2.6 面板在下，背板在上。两侧用塑料板密封，并用夹子夹好。底部调节使之水平 2.7 将加入催化剂后的凝胶沿凹口均匀倒下，插入适当的封条。勿使封条下留下气泡。用夹子夹紧封条部位 2.8 室温聚合30分钟，小心取出凹口处封条，用水冲洗加样孔（否则封条所残留的丙烯酰胺在加样孔聚合产生不规则表面，引起DNA带变形） 2.9 将凝胶固定在电泳槽里。带凹口背板朝里，面向缓冲液槽 2.10 用0. 5×TBE灌满电泳槽的缓冲液槽，接上电极，打开电源。调试工作环境为电压2000-2200V，电流150-200mA，单板电泳功率为80W。预热30分钟左右。 2.11 点样之前需切断电源，用枪将点样孔的气泡及胶吹出，然后插入点样梳，注意不要插得太深，否则点样胶面会变形，影响美观及点样。 2.12枪吸加样品，PCR产物先加loading buffer 10ul ,再变性5分钟左右，接着在冰水中冷却5分钟以上方可点样，点样完毕，电泳开始。 2.13 电泳至所需位置后，切断电源，拔出导线，回收缓冲液，卸下玻璃板。在工作台上，将背板撬起，放回原处。将面板进行银染 3. 电泳后的银染检测 3.1 原理：影像产生是由于核酸在胶上所占部位与周围的氧化——还原势不同而产生。银染液中的银离子（Ag+）可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，这样核酸电泳带就染成了黑褐色。 3.2 银染 银染液的配制：称2.5至3.0g AgNO3l水 银染:将电泳完的面板首先在银染漂洗盆了漂洗赶紧，使胶面上没有异物。玻璃板反面没有污染物。 将加入银染液的银染盆放在摇床上后，将面板放入银染1小时左右。 3.3 显影 显影液的配制：NaOH20g, Na2CO30.6g,甲醛4.5ml，加水1200ml 显影：将面板从银染盆里取出，在银染漂洗盆里漂洗，震荡5-6次，取出后使其表面尽量无水，再放入已加入显影液的显影盆里（显影，显影液的配制及甲醛的加入都需要在通风橱的摇床上进行）显影过程大约10到15分钟，以DNA条带清晰可见为准。 将显现完毕的板子在显影漂洗盆里漂洗后，方可读带。 本实验室凝胶电泳相关常用试剂配方： 我实验室常用的聚丙烯酰胺凝胶是6%变性聚丙烯酰胺凝胶（简称变性胶，PAGE），就是在普通聚丙烯酰胺凝胶中加入变性剂。我们使用的变性剂是尿素。 6%PAGE具体配制方法为: 尿素210g，10×TBE 25ml ，丙烯酰胺28.5 g ，亚甲双丙烯酰胺 1.5g，加水定容至500ml，过滤后使用。 考虑到方便使用的问题，一般一次配制2L（尿素840