间质细胞mTOR信号通路活化加重CC14所致肝纤维化-老年医学专业论文.docxVIP

硕士学位论文间质细胞mTOR信号通路活化加重CCl4所 硕士学位论文 间质细胞mTOR信号通路活化加重CCl4所 致肝纤维化 硕士研究生：单兰兰 指导教师：戴萌 摘 要 一、研究背景 肝纤维化是全球发病率较高的疾病，它不是一个独立的疾病，许多慢 性肝脏疾病均可引起肝纤维化，包括慢性病毒性肝炎，酒精性肝炎和非酒精性脂 肪肝炎等。肝纤维化是指由各种致病因子所致肝损伤修复的过程伴随结缔组织 异常增生，以肝内弥漫性细胞外基质(ECM)过度沉积为特点的病理过程。越来 越多的研究着眼于肝纤维化的病理机制，肌成纤维细胞(MF)以其合成并分泌 胶原促进肝脏ECM的累积和收缩能力成为研究的热点。MF虽来源广泛，肝星 状细胞(HSCs)依然是CCl4所致的小鼠肝纤维化模型中肌成纤维细胞的主要来 源。肝损伤时HSCs由静止的富含维生素的星状细胞活化为具有增殖、收缩和 促纤维化能力的肌成纤维细胞，这样的细胞转变在理解肝纤维化发病机制的道 路上具有划时代意义。HSCs不仅在肝损伤具有重要的功能，在肝发育、再生、 异型生物质反应、代谢、免疫调节方面都发挥着重要的作用。与此同时，无数 的研究利用组织免疫组织化学鉴定肝星状细胞，但迄今为止最具代表性的蛋白 质包括平滑肌肌动蛋白(Q．SMA)、 结蛋白(desmin)和胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)。 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammalian target ofrapamycin)是 一种高度保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。其在体内由两种不同的复合物组成， T 万方数据 摘要分别是mTORC 摘要 分别是mTORC 1(mTOR complex 1)和mTORC2(mTOR complex 2)。mTORC 1 包括mTOR、Raptor、mLST8、PRAS40和Deptor；mTORC2包括mTOR、Rictor、 mSINl、Protor-1、LST8和Deptor。结节性硬化复合物(TSCl／2)哇I TSCl和TSC2 组成，对mTOR功能起负性调控作用，TSCl的缺失会导致组织细胞中mTOCl 活性的持续激活。mTOCl可对细胞内外多种刺激产生应答反应，通过磷酸化 其下游蛋白4EBPl和P70S6K，进而增加mRNA翻译效率，增加蛋白质合成， 调控细胞生长和增殖。在一定条件下，通过雷帕霉素抑制mTORCl活性可以促 进凋亡。mTOR的突变激活会引起凋亡抵抗，可能导致细胞转化。 据报道，mTOR信号通路活化与多种纤维化疾病有关。mTOR信号通 路在心肌纤维化中起重要作用，雷帕霉素作为mTOR信号通路抑制剂可以缓解 心脏纤维化。雷帕霉素类似物SDZ和RAD对博莱霉素致小鼠肺纤维化模型中 胶原积累有明显的抑制作用，抑制mTOR对肺纤维化有潜在的治疗作用。 mTORCI信号信号通路可以促进肾成纤维细胞的活化，并有助于肾间质纤维化 的发展。越来越多的证据支持mTOR信号通路在肝纤维化起重要作用。肝星状 细胞激活是肝纤维化的发病机制中的关键步骤。肝星状细胞是位于Disse间隙 内，紧贴着肝窦内皮细胞和肝细胞的间质细胞。我们推测的mTOR信号通路在 间充质细胞激活对肝纤维化有重要作用。 二、研究方法 1、基于Cre．10xp系统，我们成功构建了间质细胞特异性TSCl敲除小 鼠。应用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行小鼠基因型的鉴定。 2、他莫昔芬诱导间质细胞特异性TSCl敲除小鼠，用western blot和 免疫荧光确定TSCl敲除效果。 3、采用四氯化碳(CCl4)dx鼠腹腔注射给药，模拟肝纤维化模型，对照 组给予同等剂量甘油。检Nd,鼠血清的ALT，肝组织检测匀浆羟脯氨酸(HYP)。 取肝组织进行HE和天狼星红染色，观察小鼠肝组织的损伤程度和胶原增生的 II 万方数据 硕士学位论文情况。 硕士学位论文 情况。 4、在小鼠动物模型，通过免疫组化及western blot方法，评估在间质 细胞内mTOR过度活化情况下对肝纤维化形成的影响。 5、通过对间质细胞特异性敲除TSClmRNA分析，初步探讨mTORCl 信号通路对促纤维化发生发展的基因的影响 6、在小鼠动物模型，使用western blot检测及免疫荧光来评估小鼠肝 组织内的增殖及凋亡水平变化情况。 三、统计学处理 所有数据均代表3次或以上重复实验的结果，以均数±标准误表示， 每组数据使用t检验进行分析。检验水准：PO．05有统计学意义。 四、研究结果 l、构建间质细胞特异性TSCl敲除小鼠，并对2月龄小鼠进行他莫昔 芬诱导，使其产生敲除效果。 纯合子TSCl小鼠(TSClⅣn)与含有Cre．ER(T)重组酶基因的小鼠杂交 繁殖出Cre／TSCl杂合的老鼠。经过第二代杂交繁殖出Cre酶阳性纯合子 [TSCl彤n，Colla2．Cr