基于自身抗体谱检测型免疫芯片的制作研究与临床初步应用-生物医学工程专业论文.docx

东南火学 东南火学 l尊士学位论文 中文摘要 毕业论文题目：基于自身抗体普检测型免疫芯片的制作研究与临床初步J堂J1] 生塑医堂至猩专业兰立嫂级博士生 姓名：虞叠 指导教lJl]i：题主垫蜓 生物芯片是通过平面微细加工与生物分子的自组装技术相结合，在固体基片上组 装成数目众多的不同生物分子微阵列，以实现对目标DNA、RNA或蛋白质分子信息的大 规模检测。这种技术被认为是生命科学研究中的高效工具，因而成为目前国内外科学技 术发展的热点。蛋白质免疫检测型芯片有别于一般的DNA芯片检测技术，其原理主要 是基于抗原与抗体的特异结合反应来设计的，所测目的分子仅有结构上的专一性，而无 序列特异性。本文在分离制备多种生物大分子的基础上，采用分子组装技术，探索出一 种新型的适用于不同生物分子偶联的固相载体，即经氧化与化学修饰处理的琼脂糖凝胶 基片，成功地在其表面制作了抗原与抗体分子微阵列，建立了3种不同免疫检测模式， 包括直接模式、间接模式和双抗体夹心模式，可敏感特异检出抗原、抗体分子及酶与底 物之间的相互作用：同时采用辣根过氧化物酶一二氨基联苯胺一双氧水(HRP．DAB—H202)、 胶体金一硝酸银．对苯二酚和荧光素3种不同示踪剂作为蛋白质与抗原分子微阵列的信号 显示系统，均取得了较好的效果。经初步对临床疾病标本的研究发现，本法制作的蛋白质 与抗原分子微阵列用于自身抗体的检测表现出较好的方法学稳定性和重复性，与ELISA 测定结果有较好的一致性，并具有操作简便、结果特异、实验条件易于控制、所需样本 和试剂用量小等特点，对于实现高通量的生物分子检测具有重要的意义。 本论文的主要研究工作 1．利用生物化学、免疫学和分子生物学技术，具体的实施方法包括用饱和硫酸胺盐析、 差速离心、凝胶色谱分析(分子筛、硅胶柱层析和亲和色谱)、薄层层析技术、聚丙烯 酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳对待分离的组分进行分离纯化。制备了10余种不同的 生物大分子抗原探针(包括蛋白质、DNA和磷脂分子等)，同时就有关自身抗体的检测 方法、生物大分子抗原(主要为蛋白质)的一般理化特性、分离纯化原则和基本的实验 技术进行了讨论。这些自身抗原分别是甲状腺球蛋13(TG)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、 肌红蛋白(Mb)、肝特异性细胞膜脂蛋I刍(LSP)、ENA抗原、精子膜抗原(SmAg)、热聚合 兔IgG(AgRIgG)、子宫内膜抗原(EmAg)、人卵巢抗原(O—Ag)，心磷脂，dsDNA和ssDNA ————叁塑盔兰堡主堂垡堡墨-——————————————一等。临床上多用其作固相探针进行相关自身抗体的检测和疾病诊断，这些抗原分子的获 ————叁塑盔兰堡主堂垡堡墨-——————————————一 等。临床上多用其作固相探针进行相关自身抗体的检测和疾病诊断，这些抗原分子的获 得为后续微阵列的制作提供了必要的“实验材料”。 2．利朋不同的化：学试剂对普通的栽玻片进行修饰处理，得到了5种不同的固相化表面， 它们分别是氧化型琼脂糖凝胶组装膜、APTES—GA修饰表面、APTES修饰表面、PLL-GA 修饰表面和PLL修饰表面。同时以不同浓度和不同状态的辣根过氧化物酶(HRP)、人 lgG分子制作微阵列，以观察固相酶与特异底物、及人IgG与抗人IgO分子之间的相互 作用，列其用于蛋白质分子的固定效率进行评价。结果发现生物分子的固定效果除与所 选的固相表面特征不同有关外，还与其本身的性质、所处的物理状态(包括分子的种类、 结构、分子量大小和表面电荷等)及不同pH缓冲体系有直接关系。上述5种修饰表面中， 以氧化型琼脂糖凝胶组装膜和pH9．6的碳酸盐(0．05mol／LCBS)缓冲液用于蛋白质分子的 固定效果最佳。AFM表征结果提示，琼脂糖凝胶组装膜是一种三维化的表面结构，与 二维表面相比较，具有较高的荷载与结合蛋白质分子的潜能，该凝胶基片有可能发展成 为理想的、适用于其他生物分子组装的固相化表面。 3．于氨基硅烷化的载玻片表面制作琼脂糖分子自组装膜，经高碘酸钠(Nal04)氧化和 戊二醛(GA)分子偶联后，得到了3种不同的琼脂糖凝胶表面(分别为表面1、表面2 和表面3)。对其固定生物分子的偶联效率、检测敏感度和稳定性能进行了考证和对比研 究，并采用酶免疫分析技术(ElA)、原子力显微术(AFM)与X射线光电子能谱(XPS) 对端基的氧化修饰、基片表面的反应特性及蛋白质分子的固相化过程进行表征。结果发 现：基于表面3制作的阵列芯片具有较高的蛋白质分子固定效率、检测灵敏度和较好的 热稳定性，温度因素对其用于自身抗体的检测无显著影响。AFM可观察到人IgG分子 组装于琼脂糖凝胶表面，XPS则可探测到Nls峰的存在。研究结果提供了氧化修饰的琼 脂糖凝胶表面成功用于蛋白质分子固定的直接证据和内在机制。表面