甲基对硫磷水解酶高活筛选及荧光纳米分子生物传感器的研究-微生物学专业论文.docx

华中农业大学学位敝独创性声明及使用=’／Y㈣1煳辫学位论文 华中农业大学学位敝独创性声明及使用=’／Y㈣1煳辫 学位论文 是否必威体育官网网址 否 如需必威体育官网网址，解密时间 年 月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：刁今牢电 时间：如『，J年么月6日 学位论文使用授权书 撇黼张琳 新鲐罪劾恩 签名日期：抽护年6月6日 签名日期：z叫。年多月7日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 ．} ．} 目录摘要 目录 摘要 ABSTRACT ” 第一章有机磷农药污染及其检测 ··3 l有机磷农药的概述 3 1．1有机磷农药使用现状 3 1．2有机磷农药的分类 4 1．3有机磷农药的毒性问题 ”5 1．4有机磷农药的环境污染和残留问题 6 1．4．1土壤污染 ·7 1．4．2水体污染 ·7 1．4．3大气污染 ”8 1．4．4破坏生态平衡和生物多样性 ·8 1．5农药污染的防治措施 8 2有机磷农药降解酶的研究进展 9 2．1有机磷农药降解微生物的分离 9 2．2有机磷水解酶的研究进展 “1l 2．2．1有机磷水解酶的基因定位和性质研究 ”12 2．2．2有机磷水解酶精细结构的研究 13 2．3甲基对硫磷水解酶的研究现状 ”16 2．3．1甲基对硫磷降解菌的分离和利用 16 2．3．2甲基对硫磷降解途径的研究 17 2．3．3甲基对硫磷降解基因及其水解酶的研究 18 3农药残留检测的研究进展 ～21 3．1色谱法(Chromotography) 2 1 3．1．1气相色谱法(Gas Chromatography，GC) 21 3．1．2高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)22 3．1．3薄层色谱法(Thin-layer 3．1．3薄层色谱法(Thin-layer chromatography，TLC) 23 3．2毛细管电泳(Capillary Electropheresis) 23 23 3．3 光谱法 ”24 3．4生物传感器 ．．24 3．4．1酶传感器 ”25 3．4．2微生物传感器 。26 3．4．3免疫传感器 ．26 3．4．6纳米传感器 ．27 3．5结束语 27 第二章甲基对硫磷水解酶的高酶活筛选研究 ··29 1材料与方法 ．．30 1．1材料 ．30 1．1．1菌株与质粒 ．30 1．1．2培养基及抗生素 ．3 l 1．1．3试剂与材料 “32 1．1．4溶剂和缓冲溶液 ”32 1．1．5仪器与设备 “33 1．2实验方法 34 1．2．1 1．2．1 1 MPH酶学活性测定 38 1．2．12 MPH酶动力学参数测定 ”38 1．2．13 MPH的体外定向筛选 38 2结果 ·42 2．1 mph基因表达载体的构建 ·42 2．1．1 mph基因的扩增 “44 2．1．2 pET20b(+)一mph重组质粒的验证 44 2．2 MPH的表达纯化 45 2．3 MPH的体外定向筛选试验设计和突变文库的筛选 46 2．3．1 Error-prone PCR体系的设计 “46 2．3．2突变文库的筛选 47 2．3．3突变株动力学性质分析 ·47 2．3．4保存稳定性的测定 ”48 3讨论 ”50 第三章荧光纳米传感器检测甲基对硫磷的研究 51 l材料与方法 53 1．1材料 ”53 1．1．1菌株和质粒 ··53 1．1．2培养基及抗生素 ·54 1．1．3试剂与材料 ”55 1．1．4溶剂和缓冲溶液 “55 1．1．5仪器与设备 56 1．2实验方法 ·57 1．2．1大肠杆菌质粒的提取 ”57 1．2．2 e铴基因的PCR扩增及表达载体构建 57 1．2．3 e29fp-mph基因片断克隆载体的构建 ··58 1．2．4 P砀一mph基因的PCR扩增及sup35,石％29fp．mph基因克隆载体的构建 ·60 1．2．6 MPH、E2GFP、E2GFP．MPH和Sup35I61．E2GFP．MPH的诱导表达·6l III 1．2．7 1．2．7 MPH、E2GFP、E2GFP．MPH和Sup35i-61．E2GFP．MPH的纯化 ．61 1．2．8蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳及透析 ·62 1．2．9蛋白质浓度的测定 ·63 1．2．10蛋白自主装成纳米线 ·63