口腔黏膜上皮细胞体外培养与温度敏感性支架材料研制的实验研究-临床专业毕业论文.docxVIP

复旦大学硕士学位论文中文摘要 复旦大学硕士学位论文 中文摘要 作为一种来源充足、具有良好生理学活性、能有效避免排斥反应的角膜替代 物，组织工程角膜已成功地应用于多种损伤修复，其中角膜上皮的构建对于角膜 缘干细胞缺乏患者的治疗具有指导意义。支架材料的应用与种子细胞的选择对于 组织工程技术至关重要，如何利用组织工程技术构建具有良好生物学活性、发挥 正常生理功能的组织工程角膜，具有重要的探索价值与临床实际应用意义。支架 材料是细胞增殖的场所，同时引导细胞生长，决定着所构建组织的形态。随着组 织工程学的不断发展，人工合成智能高分子材料在生物医学中的应用已越来越广 泛。聚N．异丙基丙烯酰胺是一种快速温度敏感型智能高分子，由于其对外界微 小温度刺激能引起微观结构迅速而可逆的变化，使得上皮层与材料层之间得以顺 利脱离，因而避免了移植后材料的生物降解问题，形成了“无载体的支架材料。 口腔黏膜取材方便，来源丰富，而且口腔黏膜上皮中广泛分布着干细胞，体外扩 增能力较强，因此，利用口腔黏膜上皮细胞作为种子细胞进行眼表重建成为研究 热点。 本研究分为两部分：第一部分拟应用聚N．异丙基丙烯酰胺接枝于聚苯乙烯 膜，制备具有温度敏感性的支架材料，了解其生物学性能；第二部分拟利用兔口 腔黏膜上皮细胞进行体外培养，了解其扩增规律。为进一步利用V1腔黏膜上皮细 胞为种子细胞，温度敏感性材料为支架材料，修复角膜上皮缺损奠定基础，为临 床上治疗角膜缘干细胞缺损的患者提供新的思路。 复旦大学硕士学位论文第一部分 复旦大学硕士学位论文 第一部分 温度敏感性支架材料的研制 【目的】通过研制温度敏感性高分子共聚膜，了解其化学特性，为进一步应用“无 载体支架材料进行细胞培养奠定基础。 【方法】以电子束为辐射源，将N．异丙基丙烯酰胺烈IPAAm)接枝到聚苯乙烯(PS) 膜上，制得PS—g-NIPAAm-元共聚物。通过称重测定聚合反应的接枝率：以红外 光谱仪测定共聚物的化学组成；以接触角测量仪测定共聚物的亲／疏水性；以差 热分析仪测定共聚物的相转变温度(LCST)；测定不同环境温度下(25,--．45。C)共聚 物膜的溶胀比，得到其脱溶胀和再溶胀的动力学曲线，明确共聚物膜的溶胀性能； 以电子显微镜观察聚合膜的超微结构。 【结果】PS—g-NIPAAm共聚物膜接枝率为39．2％，红外光谱仪测定发现约 1650cm。1处出现氨基与羰基的重叠峰，均证明NIPAAm已接枝在PS膜上。共聚物 膜的接触角为46．9。，证明疏水的PS膜接枝NIPAAm后具有亲水性。共聚物的 LCST为35。C左右，在LCST以下溶胀，其溶胀率比可高达干膜的十倍左右，在 LCST以上发生脱溶胀而收缩，变得几乎与干膜一样。电子显微镜下，NIPAAm 广泛分布于PS膜上。 【结论】PS—g-NIPAAm共聚膜具有良好的温度敏感性与溶胀性能，为“无载体” 支架材料的应用提供理论依据。 【关键词】辐照接枝；温度敏感性；聚N．异丙基丙烯酰胺 复旦大学硕士学位论文第二部分 复旦大学硕士学位论文 第二部分 口腔黏膜上皮细胞的体外培养 【目的】通过体外培养兔口腔黏膜上皮细胞，掌握其扩增规律，为进一步利用口 腔黏膜上皮细胞为种子细胞重建角膜上皮奠定基础。 【方法】取新西兰白兔口腔黏膜组织小块，用Dispase分离后经胰酶．EDTA消化 成单细胞悬液，接种后静置培养，定期换液。以相差显微镜每日动态观察细胞形 态变化及生长增殖情况，行常规组化染色，并通过透射电镜，观察其超微结构。 测定细胞生长曲线及克隆形成率，了解细胞生长基本规律及其增殖能力。 【结果】生长良好的口腔黏膜上皮细胞为卵圆形，细胞连接成片呈铺路石状，胞 核较大，无异常核分裂相。透射电镜下，上皮细胞核大呈圆形或卵圆形，胞质内 可见正常细胞器，胞浆内含大量的张力纤维，呈网状或束状排列，细胞表面有许 多微绒毛。细胞接种后第1~4天为静止生长期，第乱11天处于快速生长期，第13 天后进入平台期。接种密度为200／em2时，培养细胞克隆形成率为0．75％。 【结论】口腔黏膜上皮细胞可在体外进行培养，在一定时间内保持良好增殖能力， 为组织工程化口腔黏膜上皮应用于眼表重建奠定了基础。 【关键词】组织工程；细胞培养；口腔黏膜；上皮细胞 复旦大学硕士学位论文Abstract 复旦大学硕士学位论文 Abstract A study of the preparation of a temperature-sensitive scaffold material and the culture of oral mucosal epithelial cells in vitro As the substitution of cornea,tissue engineering is applied