环境污染物DBP和AFTM1单克隆抗体制备及人体内暴露水平研究-药学专业论文.docxVIP

环境污染物I)BP和AFTMl单克隆抗体制备 环境污染物I)BP和AFTMl单克隆抗体制备 及人体内暴露水平研究 浙江大学药学院： 微生物与生化药学 13级研究生： 周丽芳 导 师： 陈枢青教授 中文摘要 随着科技的进步，经济的发展，环境问题越来越凸显。2013年全国肿瘤登记 中心对2010年收集到的肿瘤数据进行审核、整理和分析后发现近几年肿瘤疾病的 负担日益严重，特别提到与环境相关的健康问题应作为焦点进行跟踪监测。作为 导致重要疾病的因素之一，环境问题受到越来越多人的关注与重视。 之前对环境污染物质检测的研究大多是针对大气、土壤、食物等外环境的监 测，这些数据可以间接反映小分子环境污染物的主要暴露来源，从源头控制人类 过多的暴露。直接对人体尿样、血样等生物样本中的环境污染物质进行内暴露检 测能够客观的反映个体内暴露水平，避免个体差异的影响；更有效的预测、预防 特定环境污染物暴露剂量对人体危害；同时可以为环境管理者在研制有害物质及 致癌环境卫生学标准、提出环境中有害化学物及致癌物的可接受浓度时提供科学 理论依据，进而指导国家卫生部门制定更有效的政策，提高国民的健康状态。 目前针对小分子环境污染物的检测方法有仪器分析法和免疫学分析方法两 种，传统的仪器分析法(HPLC、GC．MS等)不仅操作复杂，价格昂贵，通量低 而且耗时长、灵敏度低，这些缺点限制了其在普通人群中的应用与普及。免疫学 Il 万方数据 的方法采用抗原抗体特异性结合的原理进行检测。目前由于小分子环境污染物质 的方法采用抗原抗体特异性结合的原理进行检测。目前由于小分子环境污染物质 完全抗原的质量低、抗体的特异性差以及方法的灵敏度低、通量低等严重的阻碍 了小分子环境污染物质检测技术的发展与应用。 本研究在通过细胞融合技术、高强度多次的亚克隆筛选到特异性好、效价高 的单克隆抗体的基础上，建立一种灵敏度高、通量高且操作简便的检测方法，使 其能够适用于大批量环境污染物邻苯二甲酸z_-j-酯(Dibutyl phthalate，DBP)和黄 曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFTMl)内暴露样本的检测。绝大多数小分子环境污 染物分子量小，只具有反应原性，而不具有免疫原性，因此针对同-／J,分子环境 污染物需要首先合成2种不同的人工完全抗原作为免疫原和包被原，再选择制备 亲和力高的特异性抗体，建立、优化检测方法后，对浙江省普通人群体内的DBP 和AFTMl进行检测分析，获得该人群内暴露水平的第一手资料。 一．两种小分子环境污染物人工完全抗原的制备与获得 小分子环境污染物如邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、黄曲霉毒素M1(AFTMl)， 分子量分别为278．34与328，这类物质分子量小、结构简单，必须与载体蛋白结 合制备人工完全抗原后才能有效的刺激动物体内产生特异性的抗体。常用的载体 蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵血清白蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)及 多聚赖氨酸(PLL)。偶联臂的应用可以使得半抗原远离大分子载体，避免小分子 半抗原被载体大分子遮盖影响其免疫原性，更好的刺激免疫系统。目前应用的连 接臂原形有酸酐、碳二亚胺、戊二醛等。根据半抗原的结构基团，分子中含有羧 基和可羧化的半抗原可使用混合酸干法与碳二亚胺法，戊二醛法与重氮化法用于 含有氨基或者可还原硝基半抗原的小分子偶联，而含有羟基的半抗原可采用琥珀 酸酐和羰基二咪唑作为偶联臂。 针对DBP小分子环境污染物，该研究选用BSA与OVA作为偶联载体。在 4．硝基邻苯二甲酸的基础上，首先创新型的选择催化剂进行酯化合成4．硝基邻苯 二甲酸二丁酯，然后选择最优的还原剂还原得到具有氨基结构的4．氨基邻苯二甲 酸二丁酯，最后通过重氮化反应偶联蛋白载体获得2种人工完全抗原。DBP．BSA 作为免疫小鼠的免疫抗原，DBP．OVA作为建立方法的包被抗原。优化实验条件 Ill 万方数据 后，该合成方法较文献中的方法产率提高，合成时间缩短。AFTMl．BSA和 后，该合成方法较文献中的方法产率提高，合成时间缩短。AFTMl．BSA和 AFTMl．OVA的2种小分子环境污染物人工完全抗原则通过购买获得，前者作为 免疫抗原，后者作为包被抗原。 二．两种小分子环境污染物单克隆抗体的制备与检测方法的建立 来自于同一株细胞的单克隆抗体比来自于不同只动物获得的多克隆抗体相 比，具有更高的特异性、更好的均一性并且可以体内外大量制备，其来源和产量 丰富等优点。因此我们采用经典的细胞融合的方法筛选得到阳性杂交瘤细胞并通 过体内培养、体外纯化获得足量的单克隆抗体。继而通过优化包被抗原浓度、抗 体浓度-9抗体稀释液等多个条件建立最优化的间接竞争ELISA(indirect complete enzyme-linked immunosorbent