课件：第七章蛋白质或多肽的放射性标记及分析方法.ppt

体内标记法的特点： 标记蛋白质的性质不会有任何改变，能同时标记多个器官或多种组织的蛋白质。在研究整体代谢方面，体内标记是不可缺少的。但它的应用有其局限性，这是因为： ① 标记前体或化合物通过道谢通路参加蛋白质，由于代谢库的稀释作用，供细胞合成蛋白质所用的标记前体或化合物的比放射性降低，并且难以测定； ② 代谢库本身有随代谢速率而变，故难以估计； ③ 放射性物质用量大，既造成浪费又易造成污染。 （2）体外标记法（in vitro） 体外标记法主要是借助细胞培养技术，把标记前体或化合物加入到培养液中，细胞通过生物合成而完成标记的方式。一般多用氨基酸或有机离子作为标记物，故他们很容易穿古过细胞膜。 与体内标记相比，体外标记的最大优点是可以精确控制温度、pH、离子强度等环境因素。同时，可对不同组织或器官以及不同生长时期的细胞进行标记。 二、标记蛋白(多肽)的分离技术 不论采用前述中的任何标记方法，得到的产物均是各种物质的混合物，因此需要进行分离和纯化。 根据被分离物质的分子量，电荷等物理性质及状态的不同，可采用吸附与分配层析、离子交换层析、凝胶层析、素和层析、电泳、超速离心、色谱等技术进行分离。 下面着重介绍以125I标记胰岛素时，所得各种混合物的分离技术。 用125I标记胰岛素时，混合物主要包括： 1、未标记胰岛素； 2、四种单碘标记胰岛素； 3、双碘及双取代胰岛素； 4、损伤而未被标记的胰岛素； 5、损伤的标记胰岛素； 6、游离的无机盐离子，如125I-； 7、其他（如氧化剂或酶及其降解产物等）。 分离纯化常用的方法主要有： 1、分子筛法 单碘胰岛素分子中的Tyr酚环羟基邻位上的氢原子被一个碘原子置换后，酚羟基的pK值从10.1下降到8.6，被两个碘原子置换，pK值降至6.8。在pH 8.6时，原型胰岛素所带的净电荷为单碘胰岛素的一半，pH为6.8 时，则差别更大。根据在相同pH时，碘化胰岛素所带静电荷不同于原型胰岛素的原理，有人用离子交换层析，或聚丙烯酰胺凝胶电泳法将标记胰岛素和未标记胰岛素分开。 2、离子交换法 用DEAE-Sephadex A25，AE纤维素，Amberlite IRA-400阴离子交换树脂，采用梯度洗脱或改变洗脱液离子强度或pH等方法，可将未标记胰岛素、标记胰岛素（包括单碘、双碘胰岛素）、双取代或双碘胰岛素逐一洗脱下来。但是此法并不能分离碘化位置不同的单碘胰岛素。 3、聚丙烯酰胺凝胶电泳法 此法首先于1959年由Omstein和Darris报道。由于其操作简便，仪器简单，分辨率高，而被广泛应用于生物化学及分子生物学研究。 1974年被用于碘化胰岛素的分离，此后不断得到改进。此法能将标记胰岛素与未标记胰岛素，损伤碎片及游离125I-等无机盐分开，还可将单碘A14和A19，双碘胰岛素等分开。 聚丙烯酰胺是由95%的丙烯酰胺和5%双甲叉丙烯酰胺经过硫酸铵活化聚合而成。 电泳过程中，由于电荷效应和分子筛效应的差别，Rf值不同，使标记混合物中各种成分能得到分离，A14和A19单碘胰岛素虽然都标记一个125I-，但亦能被分开；确切机理尚不清楚。B16和B26单碘胰岛素与A19标记物Rf值相同，不能分开。 无机盐（包括125I-），在此系统中泳动最快，在指示染料带之前，能满意除去。 由此得到的A14和A19单碘胰岛素质架期可达6个月。 其他如等电聚焦法亦可获得较纯的A14和A19单碘标记物，但方法较复杂，仪器和试剂要求教高，不尽实用。 4、聚丙烯酰胺凝胶电泳加QAE阴离子交换层析 单独采用以上任意一种方法，多不能达到将B16和B26单碘标记物分离出来的目的。国外近年采用聚丙烯酰胺凝胶电泳加QAE阴离子交换层析的方法，得到四种单碘胰岛素（图7－8）。 5、反向高效液相层析（RP-HPLC） 近年来，采用反向高效液相层析（RP-HPLC）制备柱分离胰岛素标记物已有报道，发现有较大优点。如：省时、效率高、成本低、分离完全、能得到高比放射性高生物活性的四种单碘胰岛素（图7－9、10）。 三、标记蛋白(多肽)的分析方法 由于在“一”中，利用各种标记方法所得的标记蛋白质均非单一，而是多种蛋白的混合物。为了探明某种特定蛋白质的结构和功能，一方面要建立分离方法，另一方面要建立有效的分析手段。 1、抗原—抗体放射性免疫分析 这种分析方法是利用抗原和抗体反应的特异性，在蛋白质混合物中加入特异的抗体，形成抗原-抗体复合物，从而检测和定量蛋白质混合物中的目的抗原。通过与蛋白质放射性标记及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合，这种分析方法可检测出低至100 pg的放射性标记蛋白。 2、凝胶电泳和放射自显影分析 标记蛋白质电泳谱的分析，大致可分为放射