课件：真菌的遗传分析.pptVIP

理想的分子标记必须达以下几个要求： 具有高的多态性； (2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型； (3) 能明确辨别等位基因； (4) 遍布整个基因组；除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组； (5) 选择中性(即无基因多效性)； (6) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)； 2019 - * (7) 开发成本和使用成本尽量低廉； (8) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。 但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求。 2019 - * 1、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) RFLP是1980年建立的第一代分子遗传标记。 原理：用限制性内切酶切割不同个体的DNA时，如果存在酶切位点的变化，就会产生长度不同的DNA片段，电泳后用克隆探针检测时，就会出现泳动行为的改变。 基本过程：取得DNA样本——酶切——电泳——转移至硝酸纤维膜上——DNA探针杂交——放射自显影 2019 - * 2019 - * 2019 - * RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。 RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。 2019 - * PCR—RFLP 如果已知多态性位点周围的DNA序列，则可用PCR快速而简单地进行RFLP分析。 首先根据多态位点两侧序列设计和合成引物；以基因组DNA为模板进行PCR扩增；用相应的内切酶进行消化；再进行电泳，分析PCR区带判断多态性。 2019 - * 2019 - * 2、数目可变串联重复多态性(Variable Number of Tandem Repeats，VNTR) 数目可变串联重复序列又称小卫星DNA (Minisatellite DNA)，是一种重复DNA小序列，为10到几百核苷酸，拷贝数10一10001不等。VNTR基本原理与RFLP大致相同，只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求：(1)限制性内切酶的酶切位点必须不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性。(2)内切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列，通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。(3)分子杂交所用DNA探针核昔酸序列必须是小卫星序列或微卫星序列，通过分子杂交和放射自显影后，就可一次性检测到众多小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的DNA指纹图谱。 2019 - * 3、随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD) RAPD技术是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法。基本原理：它是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。 2019 - * 2019 - * 与RFLP相比，RAPD具有以下优点： (1)技术简单，检测速度快； (2) RAPD分析只需少量DNA样品； (3)不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同生物基因组分析； (4)成本较低。 但RAPD也存在一些缺点： RAPD标记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子； (2)存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度DNA片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片段； (3) RAPD技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。 2019 - * 4、任意引物PCR(Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction， AP—PCR) 在AP—PCR分析中，所使用的引物较长(10－50 bp) ， PCR反应分为两个阶段，首先寡核昔酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了