定量PCR中_ct值的含义.pdfVIP

实时荧光定量PCR 一种科学准确的定量方法 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出， 由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比， 它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前 已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。 一. 实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle， t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值 时所经历的循环数 （如图1所示）。 图1.Ct值的确定 2. 荧光域值 （threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省 设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold 10´ SDcycle6-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系 〔〕 1 ，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标 准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。 因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始 拷贝数。 图2. 荧光定量标准曲线 4. 荧光化学 〔〕 2 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料 。 现将其原理简述如下： 1） TaqMan荧光探针： PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一 寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整 时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’ －3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离， 从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧 光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图3所 示。 图3.TaqMan 荧光探针工作原理 2）SYBR荧光染料： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地 掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发 射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 二．内标在传统定量中的意义 〔〕 3 1．几种传统定量PCR方法简介 ： 1）内参照法： 在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合 成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被 扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可 用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检 〔〕 4 测模板 。 2）竞争法： 选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应 管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增 （其中一个引物为荧光标 记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片 段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测 〔〕 5 定荧光