电泳技术在药物分析中的应用.ppt

电泳技术在药物分析中的应用 生检室：姚世霞 引 言 电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Re?ss进行了世界上第一次电泳实验）。1937年，瑞典生化学家Tiselius发明了Tiselius电泳仪，在此基础上建立了研究蛋白质的自由界面电泳方法，利用该法首次证明人血清是由白蛋白、α、β、γ球蛋白组成，并因此于1948年获得诺贝尔奖。随后电泳技术的发展突飞猛进,特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。 一.电泳的概念 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。 电泳技术优点：快速、准确、重现性好 二.电泳技术基本原理 1.原理： 不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有关。 pH pI 分子带负电荷,在电场中向正极移动; pH pI分子带正电荷,在电场中向负极移动; 泳动速度 电泳的基本原理 在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。 2.影响电泳速度的因素 2.1 电场强度 泳动速度与电场强度成正比。 常压电泳(100—500V). 2—10V/cm，几小时或几天；蛋白质等大分子物质; 高压电泳(500—1000V). 20—200V/cm，几分钟；氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物质. 2.2溶液的pH值 pH距待分离物质的pI越远，泳动速度越大 2.3溶液离子强度 离子强度越小,电动势越大,泳动速度越快。 2.4电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。 三.电泳技术分类 原则上按电泳的原理来分，可分为二类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。 电泳技术分类 四.几种常见电泳的比较 五.电泳技术在药物分析中的应用 药典中的收载情况 英国药典 ： 1975 年版开始将电泳收载入附录,1980版、1993 版将电泳方法增加到6 种,1998 年版又对自由移动界面电泳作了详细说明 美国药典： 1985版起开始将电泳收载入附录,并对凝胶电泳的原理、影响因素作了详细的说明,NF22 册又增加了DESK电泳。 中国药典： 1990 年版二部首次收载入附录中，1995 年版 、2000 年版、2005年版将电泳中的五种电泳技术(纸电泳法、醋酸纤维素薄膜电泳法、琼脂糖凝胶电泳法,聚丙烯酰胺凝胶电泳法、SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳法、免疫电泳法在附录中规定下来,并对高效毛细管电泳也作了详细的说明。 1.纸电泳法( paper electrophoresis) 纸电泳法：是用滤纸作为电泳支持介质的一种方法。 特点：设备简单,应用广泛；电泳时间长,分辨率较差。 应用：三磷酸腺苷二钠原料、三磷酸腺苷二钠注射液的含量的测定；胞磷胆碱钠有关物质检查。 此外，在植物化学成份的分离中得以应用,如糖类,三萜类等可利用其衍生物的方法使其分子带电荷,再用纸电泳法进行分离。 2 　醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素薄膜电泳：是用醋酸纤维素薄膜作为电泳支持介质的一种方法。 特点：电泳后区带界限清晰,分辨力强；通电时间较短；对各种蛋白质都几乎完全不吸附，无拖尾现象；对染料也不吸附；电渗作用虽高但很均一,不影响样品的分离效果, 必须在密闭的容器中进行电泳,并使用较低压电流避免蒸发。 应用：《中国药典2005版三部》中人血白蛋白、人免疫球蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、破伤风人免疫球蛋白、2000版中人胎盘蛋白、人胎盘血免疫球蛋白中的蛋白质纯度测定。 临床检验中已经广泛用于血清蛋白,血红蛋白,球蛋白,脂蛋白,糖蛋白,甲胎蛋白,类固醇及同工酶、尿蛋白等的分离分析以及免疫电泳等中 ，用于疾病的诊断。 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳( polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶电泳: 根据被分离物