【doc】聚合酶链式反应（PCR）技术在植物病害研究中的应用.doc

聚合酶链式反应（PCR）技术在植物病害研究中的应用 o——?Z- 第21卷第3期四川林业科技 2000年9月JournalofSichuanForestryScienceandTechnology Vo1.21.No.3 Sept.,2000 聚合酶链式反应(PCR)技术在植物 病害研究中的应用 窿 (南京林业大学.南京210037) 摘要:聚合酶链式反应(PcR)是20世纪束出现的新*生特技术.当前,it~X.-广泛应 用于生特学,医学,以及植特病理学等诸多帮城.本文介绍了PCR反应的原理,操作方法.综述 艚氘 南厥萄关键词:墨全堡丝盎生皇;兰苎兰弗中圉分类号:S763文献标识码:C 文章编号:1003--5508(2000)03--0070--72 五 随着分子生物学的发展,对特定核苷酸片段进行分离,纯化及扩展成为基因分子生物学研究的中心 问题.自1975年Southen转移技术建立以来,这一领域已取得了很大的进展.由于当时该技术在特异性, 灵敏性等方面往往不能达到令人满意的效果,加上操作复杂,因此,常对研究速度的提高带来极大的限 制.随着研究的深入,迫切需要一种技术能够有所突破,由Mullis等建立的聚合酶链式反应(Polymerase chainreation,简称PCR)有效地懈决丁这一问题,它能对极其微量的单拷贝特定核苷酸片段进行大量的 扩增. 近年来,聚合酶链式反应技术已得到丁广泛地应用.PCR技术及与其密切相关的RFLP,RAPD, AFLP的分子标记技术的广泛应用,已成为分子生物学及其相关学科的重要研究手段.由于PCR技术在 研究过程中具有省时,省力,扩增DNA纯度高等许多优良特性,从它诞生之Et起,就表现出旺盛的生命 力,几乎渗透于分子生物学的各个方面,极大地推动着基因分子生物学的研究. 1PCR反应的原理 用PCR方法进行基因扩增的过程,类似于体内DNA的复制过程.反应的关键是应用两个起始引 物,分别与待扩增序列相对的两条单链DNA结合,位点分别位于待扩序列的两端,与其3,端相向对应. 这样,由DNA多聚酶催化的引物链的延伸是沿着待扩增的DNA序列进行的.经过一个周期,特定片段 的DNA就得到加倍.由于新合成的DNA与扩增后的DNA四条单链结合,经过DNA聚合酶催化而延 伸,又使特定的DNA片段得到加倍.结果,随着反应周期数的增加,特定片段的DNA就呈指数方式增 加,增加倍数为2(n为反应周期数).简言之,PCR反应可以认为是由变性,模板与引物结合,引物延伸 三步构成不断循环的过程. 2PCR的操作方法 目前,有关PCR的反应多在100,ul含Taq酶的反应体系中进行,其中包括ig的基因组DNA, 收稿日期;2000—0621 3期廖太林:聚台酶链式反应(PCR)技术在植物病害研究中的应用7l 50mMKCI,10mMTris(pH8.)和2.5mMMgcl.两种起始引物的浓度均为luM,每种dNTP的浓度是 200uM.还有明胶200ug/ml及2单位DNA聚合酶,在反应物加几滴矿物油防水分蒸发. 反应的具体做法是:(1)将反应体系的温度在1分钟内从70℃升高到95℃,使DNA变性;(2)在2 分钟内降至40C,使引物与模板结合;(3)在1分钟内再加热至70c,使起始引物得以延伸.在此过程中 不需要另外加入聚合酶.如此重复20~30个周期.在最后一个周期完成后,反应的温育时间延长5～10 分钟,以确保最后一步链的延伸完成.随后用酒精沉淀法提取DNA,待用. 3PCR技术在植物病理学中的应用 PCR作为一个无细胞基因扩增系统,无论在理论研究还是实际应用,都呈现出了广阔的前景正 如它在生物学,匿学等领域上的应用一样,近年来PCR技术在植物病害研究中的应用也越来越广泛,主 要表现在下几个方面: 3.1克隆基因,进行序列分析运用PCR技术进行某一基因的克隆和次级克隆尤为方便,目前在病毒 基因上克隆得比较多.储瑞银等(1992)通过逆转录大豆花叶病毒RNA,利用PCR按术,克隆了一个 0.8kb的外壳蛋白基因,对其进行了序列分析.有关特异性基因的克隆及其序列分析,在烟草花叶病毒 (TMV),水稻矮缩病病毒等病毒上也做了许多工作.除对病原的特定基因进行研究外,近年来,运用PCR 技术分离,克隆植物的抗病基因的研究也有不步,吴玉良等(1998)运用该技术对水稻抗瘟性基因进行了 研究. 3.2鉴定抗病基因传统的植物杂交育种是根据植物的表现型来进行选择,由于这种选择往往要受到 环境条件的影响,早期很难对其农艺性状的表现做出准确判断,极大地限制着作物育种的速度.但是,目 前通过利用遗传标记对目标性状进行选择,则大大地提高育种效率1994年,陆军等就以水稻种子DNA 为模板进行过RAPD分析,鉴定了种子的抗/感病基因,提出