华东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5基因特征及流行毒株的分离鉴定-预防兽医学专业论文.docxVIP

摘要猪繁殖与呼吸综合征(porcine 摘要 猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)在临床症状上主要 表现为流产、早产、死胎、产木乃伊胎、仔猪成活率下降和育成猪呼吸系统病变等。由于猪繁殖与 呼吸综合症病毒(PRRSv)具有嗜巨噬细胞性、野生毒株的抗原多变性、抗体依赖性增强作用(ADE) 和持续性感染等特征而使针对此病的预防、治疗以及有效疫苗的研制困难重重，至今仍然没有一个 有效消灭此病的方法。本研究旨在：(1)分析华东地区部分猪场PRRSV-GP5基因的变异趋势；(2) 表达和纯化可作为EUSA包被抗原的PRRSV-GP5蛋白，制备可用于间接免疫荧光检测PRRSV病毒 的抗GP5多抗；(3)分离鉴定并获得PRRSV流行毒株。 用RT-PCR方法对流行于华东地区部分猪场的PRRSV GP5基因进行了扩增、克隆和序列分析。 结果表明，2004．2007年间检测的PRRSV毒株均属于北美洲型，大部分毒株属于亚群1，亚群1各 毒株间的核苷酸和氨基酸同源性分别为89．6．100％和90．7．99．5％，亚群1与最早分离到的北美洲毒 株Ⅵt2332的核苷酸和氨基酸同源性分别为88．1．90．2％和85．8．89．6％。 将PRRSV结构蛋白GP5基因截短后克隆至表达载体pET-30a，转化大肠杆菌，并经IPTG诱导 表达。SDS．PAGE电泳显示，重组蛋白得到了高效表达。纯化后的目的蛋白浓度达到87．5mg／L重组 菌培养液。Western blotting和间接ELISA分析表明，重组蛋白与抗PRRSV阳性血清能够发生反应。 制备的抗GP5蛋白多克隆抗体，抗体效价高达1：32768，可用于PRRSV的间接免疫荧光检测。 将RT-PCR检测为阳性的病料接种于猪肺泡巨噬细胞(PAMs)，进行了间接免疫荧光试验、电镜 观察和毒价测定。结果表明，我们在接种细胞中扩增到了特异性的GP5基因的目的片断，在细胞浆 中观察到了特异性免疫荧光，在电镜下病毒粒子的大小约为60nm。非结构蛋白2(NSP2)有29个 氨基酸的缺失病毒在Marc．145细胞中经48小时培养形成明显的细胞病变，10代培养后的毒价为 ao·59 TCID5咖11。 本研究结果为进一步研究PRRSV的变异、致病机理和免疫预防提供了一定的基础。 关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒，GP5基因，遗传变异，原核表达，分离鉴定 AbstractPorcine Abstract Porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)is characterized by severe reproductive failure in SOWS(1ate—term abortions，dead，weak and mummified piglets)， respiratory disease and increased preweaning mortality．The PRRSV possesses four characteristics that may contribute to difficulties in prevention and treatment of the disease，including production of effective vaccines．These include tropism for macrophages macrophage-lineage cells，remarkable antigenic variations among PRRSV field isolates，antibody-dependent enhancement of the virus infection (ADE)，and ability to establish persistent infection．The main objectives of the present study are(1)to analyze the variations of the GP5 genes of PRRSV isolates from some pig farms in southeastern China,(2) to express and purify the GP5 protein for ELISA coating and preparation of polyclonal antibodies to GP5 for indirect immunofluorescent detection of PRRSV,and(3)to identify and