粉尘螨磷酸丙糖异构酶克隆表达及过敏原性鉴定-临床检验诊断学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 1 粉尘螨磷酸丙糖异构酶克隆表达及过敏原性鉴定 摘 要 目的:在原核表达系统中进行表达纯化重组磷酸丙糖异构酶蛋白，并对该蛋白进 行过敏原性鉴定。 方法:①提取粉尘螨总 RNA 并逆转录成 cDNA，RT-PCR 扩增粉尘螨磷酸丙糖异 构酶基因；②将上述 PCR 产物与 pUC57 连接后，热转化至 E.coli Top10 中，涂 布于含氨苄霉素( 100 mg /L)的 LB 平板上，37℃培养过夜后从 LB 平板上挑选白 色菌落放入 LB 培养液中扩大培养，提取质粒。用 EcoR I 和 BamH I 双酶切鉴定 质粒，公司测序正确后进一步将酶切产物与 pET-32a 表达载体连接转化至 E.coli BL21；③利用生物学软件进行磷酸丙糖异构酶生物信息学分析，根据软件分析 计算所得的数据构造进化树；④IPTG 诱导重组菌株表达；产物经变性、复性、 Ni-NTA 螯合层析和 Superdex75 凝胶过滤层析纯化；用 Western blotting 实验检测 重组磷酸丙糖异构酶的免疫原性； ⑤收集 4 份来自广州医学院附属医院临床皮 试的粉尘螨过敏患者阳性血清和 2 份健康体检者血清样本，用 Western blotting、 ELISA 实验验证重组蛋白的过敏原性。进一步将重组磷酸丙糖异构酶蛋白进行人 体皮肤点刺实验，检测 44 例人体皮肤点刺中磷酸丙糖异构酶蛋白的阳性率。 结果：①结果成功构建重组的克隆载体和表达载体，PCR 结果表明在预期位置 出现与预期大小相一致特异性条带。②生物学软件分析磷酸丙糖异构酶是氨基酸 数为 247，分子质量为 27134 的疏水性蛋白。③SDS结果显示，重组磷酸 丙糖异构酶蛋白以包涵体的形式在原核生物体系中大量表达，复性纯化后的重组 磷酸丙糖异构酶纯度较高，且重组蛋白能够与抗 His-tag 单克隆抗体发生特异性 结合。④Western blotting、ELISA 结果显示，重组磷酸丙糖异构酶与 4 例粉尘螨 过敏患者血清呈强阳性反应，2 例健康对照组均为阴性。⑤人体皮肤点刺实验结 果显示，粉尘螨提取物人体皮肤点刺 44 例受试者中 16 例磷酸丙糖异构酶蛋白呈 阳性。 结论：成功克隆并原核表达粉尘螨磷酸丙糖异构酶，重组的粉尘螨磷酸丙糖异构 酶具有较强的过敏原性。 关键词：粉尘螨；磷酸丙糖异构酶；过敏原性；生物学信息 Cloning and expression of triosephosphate isomerase protein from dermatophagoides farina and allergenicity identification Abstract Objective：To express and purify the recombinant triosephosphate isomerase protein in the prokaryotic expression system and identify the recombinant protein for allergenicity characteristics. Methods ： ① Triosephosphate Isomerase was amplified by RT-PCR after the total RNA of dermatophagoides farinae was extracted. ② The recombinant plasmid were transformed into E.coli Top10 following PCR products and pUC57 being connected. Then the recombinant E.coli Top10 strain was cultrured in LB media with ampicillin (100 mg/L) at 37℃. Plasmid was extracted and identificated after being cut by double enzyme BamH I and EcoR I. The gene fragment of triosephosphate Isomerase protein was synthesized and sub-cloned in pET-32a vector. ③Using biology software predict bioinformatics analysis of the triosephosphate isomerase protein. Base on the analysis to construct