供体抗原特异性Treg细胞诱导小鼠胰岛移植耐受-外科学(器官移植)专业论文.docxVIP

华 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 PAGE 4 PAGE 4 中 文 摘 要 第一部分 小鼠胰岛细胞的分离与纯化 【目的】探讨稳定、高效的获得小鼠胰岛细胞的方法，建立小鼠胰岛分离的标准 化方案。 【方法】BALB/c 小鼠采用胆总管内灌注不同浓度胶原酶（0.5mg/ml、1mg/ml、 1.5mg/ml）和不同的水浴消化时间（10min、20min、30min），膨胀消化胰腺的方法分 离小鼠胰岛，Ficoll-400 不连续密度梯度离心法纯化胰岛。纯化出的胰岛细胞在体外 采用双硫腙(Dithizone，DTZ)进行特异性染色计算胰岛产量及纯度，并进行葡萄糖刺 激实验测胰岛功能。 【结果】不同浓度的胶原酶在不同时间内静止消化胰腺后，收获的胰岛数量有较 大的差别，其中采用 0.5mg/ml 胶原酶Ⅴ，38℃水浴静止消化 20 分钟组收获量最大为 （190±18）个胰岛细胞团，纯度约 90％。DTZ 染色后胰岛呈腥红色，形态完整。葡 萄糖刺激实验，胰岛素能随葡萄糖浓度增加而增加，高糖刺激后胰岛素释放量和低糖 刺激后分别为 0.535±0.175ng/islet 和 1.266±0.321ng/islet。 【结论】小鼠胰岛分离的过程中胶原酶的灌注、酶的浓度、消化时间、消化温度、 小鼠品系、小鼠体重等因素都会对结果产生很大影响。但胶原酶浓度、消化时间和温 度是影响小鼠胰岛分离结果的最重要因素，当胶原酶浓度为 0.5mg/ml，消化时间 20 分钟时可获得数量较多，纯度较好的胰岛细胞。 【关键词】小鼠胰岛，分离纯化 第二部分 小鼠骨髓来源不成熟树突状细胞的培养和鉴定 【目的】研究小鼠骨髓来源不成熟树突状细胞的体外培养方法，为下一步实验奠 定基础。 【方法】取 Babl/c 小鼠的后腿骨髓细胞，破红后，体外加入小鼠细胞因子 rmGM-CSF 和 IL-4 共培养，采用的细胞因子的终浓度分别为 rmGM-CSF 20 ng/ml、IL-4 10ng/ml。在含 5% CO2 的孵箱中培养 48 小时后全量换液去除悬浮细胞，加入含有同 样浓度细胞因子的完全培养基继续培养，第五天半量换液，第七天收获不贴壁细胞。 将收获的细胞用抗小鼠 CD11c、MHC-Ⅱ、CD80 和 CD86 流式抗体染色后上流式细胞 仪检测，分析结果。 【结果】镜下观察：细胞培养 48 小时后，有很多细胞开始贴壁生长，第一次全 量换液去除悬浮细胞后，细胞数量明显减少。培养到第五天，可见细胞有大量增殖， 并有很多集落样生长的细胞出现。第七天收获时，集落数量明显减少，同时细胞开始 变得疏松，很多细胞开始悬浮生长，集落里的细胞数也明显没有第五天的多，高倍镜 下可以看见细胞周围有大量毛刺。流式细胞仪检测：结果显示所得细胞中高表达 CD11c，中度表达 MHC-Ⅱ、低表达 CD80 和 CD86，其中 CD11c 阳性的占 80%以上， MHC-Ⅱ阳性的约占 40%～50%、CD80 和 CD86 阳性的不到总细胞数的 10%。说明所 得的细胞中树突状细胞的含量很高，纯度超过 80%，并且基本为不成熟的树突状细胞。 【结论】采用浓度分别为 20ng/ml 的 rmGM-CSF 和 10ng/ml 的 IL-4 和 Babl/c 小 鼠的骨髓细胞体外共同培养 7 天的方法可以获得纯度超过 80%的树突状细胞，并且基 本是不成熟的树突状细胞。 【关键词】小鼠，不成熟树突状细胞，体外诱导 第三部分 供者抗原特异性 Treg 细胞的培养和鉴定 【目的】研究小鼠抗原特异性 Treg 细胞的体外扩增方法，并鉴定扩增出来的细胞 是否具有抗原特异性。 【方法】先用免疫磁珠分选出 C57 小鼠的脾脏细胞中的 CD4+CD25+T 细胞，然后 同 Babl/c 小鼠的骨髓来源不成熟 DC 按 1:1 混合培养，并加入高浓度的小鼠 IL-2（2000 U/ml），混合培养 7 天后收获细胞，取一部分细胞进行流式分析，检测 CD4+CD25+ Fop3+ 细胞的含量。另取一部分进行 T 细胞增殖抑制试验，试验分两组：实验组：采用 CFSE 染色过的 C57 小鼠的 CD4+T 细胞、MMC 处理过的 Babl/c 小鼠的成熟 DC 细胞和扩增 出的 Treg 细胞混合培养；第三方刺激细胞对照组：采用 CFSE 染色过的 C57 小鼠的 CD4+T 细胞、MMC 处理过的昆明小鼠的成熟 DC 细胞和扩增出的 Treg 细胞混合培养。 通过抑制 T 细胞增殖能力不同判断扩增出来的 Treg 细胞是否有抗原特异性。 【结果】采用免疫磁珠分选的方法可以分选出纯度超过 90%的 Treg 细胞；使用 不成熟 DC 扩增后的细胞细胞数量明显增加，可以获得纯度在 60%以上的 CD4+C