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* 兽用生物制品技术 主讲教师：任平教授 项目七 诊断制品制造技术 任务1　血清学诊断抗原 任务2　变态反应抗原 任务3　标记抗体 任务4 单克隆抗体的制备 任务1 血清学诊断抗原抗原 凝集反应抗原 沉淀反应抗原 直接凝集反应 间接凝集反应 实例1 直接凝集反应抗原 鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集抗原制造工序 菌种选育 菌种是从多株鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌中筛选出的标准菌株（抗原结构9、121、123）和变异菌株（抗原结构9、121、122）各一株。要求：标准型菌株对沙门氏菌因子血清O9、O123凝集，对O122不凝集或轻度凝集；变异型菌株对沙门氏菌因子血清O9、O122凝集，对O123不凝集。 制造要点 工序1菌液培养 接种于硫代硫酸钠甘油琼脂扁瓶基，大量培养 工序2 灭活 0.3%甲醛溶液 工序3计数 测定菌液浓度（3亿个/ml）。 工序4标化 将两菌株稀释为不同浓度的菌液，分别与标准型和变异型的国际标准血清做平板凝集试验，标化后配制抗原的菌液合适浓度。 工序5染色 将结晶紫乙醇溶液、甘油按适当比例加入菌液中，充分混匀，即制成鸡白痢鸡伤寒多价平板凝集抗原，分装小瓶。 实例2 间接凝集抗原 以红细胞致敏为例，简介间接凝集抗原的制造方法。 工序一、4%绵羊红细胞的制备：采集绵羊的血液与等量的阿氏液混合，用pH 7.2～7.4 PBS液洗涤血细胞3次（每次3 000r/ min离心5min），每次离心后弃去上清液和白细胞，最后用PBS液配成4%的红细胞悬液。 工序二、2%鞣化红细胞悬液的制备：取5ml 4%红细胞悬液与等量1:25 000鞣酸PBS液合并，温和混匀，室温静置30min，用PBS液洗涤3次（每次2 000r/ min离心5min），然后用PBS液配成2%的鞣化红细胞悬液。 工序三、4%致敏红细胞的制备：取5ml鞣化红细胞与等量适当稀释的抗原液在50℃水浴中孵育5min或4℃过夜，加入5ml 1:100稀释的健康兔血清或含0.25%的牛血清白蛋白的PBS液，离心洗涤3～4次，用同一溶液配成4%致敏红细胞悬液。最后测定致敏红细胞的凝集价：取标准阳性血清，用平板法或试管法进行方阵滴定，以测定致敏红细胞的效价。能与最高稀释度的血清产生50%凝集的致敏红细胞的最高稀释倍数即为致敏红细胞凝集价，即最适使用浓度。 沉淀抗原 沉淀抗原的一般制备程序为：对病原进行人工培养或采集自然发病动物的组织，用适当方法破碎细胞以制成病原体的可溶性抗原，经过灭活、浓缩，即得到沉淀反应抗原。 实例介绍（沉淀抗原的制备方法） 鸡传染性法氏囊病APG抗原的制作 取传染性法氏囊病鸡的法氏囊组织，加入适量灭菌PBS液或生理盐水制成匀浆，经反复冻融或超声波裂解，于4℃浸泡24h后3 500～4 000r/min离心30min，收集上清液；沉淀物加入适当PBS液悬浮、浸泡后，再经10 000r/min离心60min，收集上清液；两次上清液合并，加入终浓度为0.1%～0.4%的甲醛溶液，37℃作用20h，即成鸡传染性法氏囊病APG抗原。将此抗原与标准阳性血清做APG试验，24h后出现1～3条沉淀线为合格。保存于-20℃。 任务2 变态反应抗原 现以牛型提纯结核菌素为例，简介其制造方法。 工序1．菌种 牛型提纯结核菌素的菌种为牛结核杆菌C68001株和C68002株。 工序2．制造要点 将上述菌种接种于不含蛋白质的苏通合成培养基液面上，置37℃培养2～3个月，获得培养物。培养物经121℃30min灭菌后，用数层纱布过滤除去菌膜，再用滤器过滤除菌，取滤液加入40%三氯醋酸溶液使其终浓度为4%，4℃静置过夜，弃上清液，将沉淀物用1%三氯醋酸水溶液重新悬浮沉淀，静置，弃上清液，重复3次，最后将沉淀物以5 000r/min离心15～30min，弃上清液。将沉淀物先加少量1mol/L 氢氧化钠溶液溶解，然后用pH7.4的PBS液稀释，最后将pH调至7.4，用灭菌滤器过滤除菌，滤液即为牛型提纯结核菌素原液。 工序3．检验与保存 组批混合，进行无菌检验、蛋白测定和效价测定，用加防腐剂的pH7.4的PBS液将牛型提纯结核菌素原液稀释为10万IU/ml，定量分装，迅速冷冻真空干燥。成品按《中华人民共和国兽药典》（2005版）进行无菌检验、安全检验、效价测定、特异性检验、剩余水分测定及真空度测定等。检验合格的产品于2～8℃保存，有效期为10年。 任务3 标记抗体 子任务1 荧光素标记抗体 子任务2 酶标记抗体 子任务1 荧光素标记抗体 荧光抗体是将荧光物质标记在抗体上，然后与相应的抗原结合，借荧光显微镜观察抗原抗体复合