β-环糊精的改性及在核酸纯化中的应用-分析化学专业论文.docxVIP

中南民族大学硕士学位论文 中南民族大学硕士学位论文 β β-环糊精的改性及在核酸纯化中的应用 I I PAGE PAGE IV 摘 要 DNA 是一切生命之源，它的纯化备受关注。DNA 所存在的环境较为复杂， 有效高纯度高浓度的纯化 DNA 一直是个较难的环节。本文所运用的吸附方法与 传统的手工提取，有机溶剂纯化法等相比，有成本低，操作简单没有有机溶剂污 染等优点。环糊精分子具有锥形的中空圆筒立体环状的独特结构，所以本文选用 环糊精为基质，对其进行简单的化学改性，制备多种环糊精衍生物，并对修饰环 糊精进行了表征，用于对 DNA 的纯化。用修饰环糊精对 DNA 进行吸附实验， 通过探讨溶液酸度、离子强度、吸附时间、DNA 初始浓度等因素对 DNA 吸附效 果的影响，优化了吸附条件。将得到的吸附等温线进行模拟处理，探讨了修饰环 糊精的吸附机理。 .选用甲苯-2，4-二异氰酸酯(TDI)为交联剂，制备了 TDI 交联 β-CD，讨论 了吸附液组成、溶液酸度、交联度等因素对 DNA 回收效果的影响。其最佳条件 为：在中性条件下，由 2.0mol·L-1NaCl，20%PEG8000 所组成的溶液进行吸附，用 TE 缓冲液进行洗脱，TDI 交联 β-CD 对 DNA 的回收率可达 100%。将 TDI 交联 环糊精微球应用于玉米样品 DNA 的分离纯化，电泳结果和紫外测得的数据均证 实 DNA 被成功提取并洗脱下来，A260/A280 在 1.7~2.0 范围，浓度较大。 .以环氧氯丙烷为交联剂，乙二胺为氨化试剂，将氨基基团接枝在 β-CD 微 球表面制备了 AE-β-CD。选用甲醛为氨基保护剂，将吸附剂表面的氨基基团掩 蔽起来，制备了 masking AE-β-CD。通过 FTIR 和 XPS 能谱对吸附剂进行了表征， 表明氨基已成功接枝在 β-CD 微球表面。AE-β-CD，在 pH5.5 的缓冲液含有 2.0 mol.L-1 NaCl 的吸附液中，5℃条件下，吸附 DNA 时间可在 10min 完成吸附，吸 附率最高为 57.6%。而 masking β-CD 在条件最优的情况下，对 DNA 的吸附率只 有 22.1%。当吸附液中加入 PEG 时，AE-β-CD 对 DNA 的回收率为 54.3%，masking β-CD 对 DNA 的回收率为 76.4%。将两种吸附剂运用到纯化玉米基因组中，紫外 测定结果 A260/A280 在 1.7~2.0 范围内，琼脂糖凝胶电泳显示基因组带明显。 .以亚氨基二乙酸(IDA)为螯合配基，制备了螯合 Zn2+、Cu2+、Fe3+的三种 亲和吸附剂。通过 FTIR 和 XPS 能谱对 IDA-β-CD 进行表征表明，IDA 成功接枝 在 β-CD 微球上。通过金属离子含量的测定表明 IDA 修饰后 β-CD 微球对金属离 子的螯合量明显高于修饰前 β-CD 微球，进一步证实 IDA 成功修饰在 β-CD 微球 表面。对 DNA 进行吸附，实验表明：当 pH 为 5.0 的吸附液含有 2.0 mol.L-1 NaCl 在低温时， Zn-IDA-β-CD、Cu-IDA-β-CD、Fe-IDA-β-CD 对 DNA 的实验最大吸 附容量分别为 63.66、88.47、18.34 mg.g-1。吸附等温线用 Langmuir 和 Freundlich 模型进行拟合，三种吸附剂对 DNA 的吸附过程更符合 Freundlich 模型，证明 DNA 的吸附是多分子层吸附。 .以双甘膦(PMIDA)修饰剂对环氧氯丙烷交联 β-CD 进行改性，将 Zn2+、Cu2+、 Fe3+螯合在 PMIDA-β-CD 上。通过 FTIR 对 PMIDA-β-CD 进行表征的结果表明， PMIDA 已成功接枝在交联 β-CD 微球上。通过修饰后剩余的 PMIDA 测定得到 PMIDA 在 β-CD 微球表面的修饰量。金属离子负载量的测定表明 PMIDA 修饰后 β-CD 微球对金属离子的螯合量明显高于修饰前 β-CD 微球，可进一步证实 PMIDA 成 功 修 饰 在 交 联 β-CD 表 面 。 实 验 结 果 表 明 ： Zn-PMIDA-β-CD, Cu-PMIDA-β-CD,Fe-PMIDA-β-CD 对 DNA 的实验最大吸附量分别为 14.86、 17.84、16.49 mg.g-1。吸附等温线用 Langmuir 和 Freundlich 模型进行拟合，三种 吸附剂对 DNA 的吸附过程均符合 Freundlich 模型，说明 DNA 的吸附是多分子 层吸附。 关键词：β-环糊精；核酸；分离；纯化；改性 III III PAGE PAGE IV Abstract DNA is the