β-甘露聚糖酶产生菌的分离鉴定及其酶学性质的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

中南民族大学硕士论文 中南民族大学硕士论文 I I 摘 要 β-甘露聚糖酶（Mannanase）是一类能水解含有 β-1,4-D-甘露糖主链的内切水 解酶，属于半纤维素酶类，在动物、植物和微生物中广泛存在。β-甘露聚糖酶在食 品、制药、饲料、造纸等方面有重要的应用价值，魔芋低聚糖是一种具有多种生 理功能的寡聚糖，利用 β-甘露聚糖酶来水解魔芋以制备高纯度的寡糖，其市场前 景十分广阔。 本文以魔芋田和魔芋加工厂废液中采集的样品为实验材料，筛选出 36 株产 β- 甘露聚糖酶的菌株，利用 DNS 法测定酶活力进行复筛，得到一株酶活力较高的 CYS4 菌株，其酶活力大小为 5.14 U/mL。另外，研究发现 CYS4 菌株是一株胞外 β-甘露聚糖酶的产生菌。 对 CYS4 菌株的 16S rDNA 序列进行测定，并在 NCBI 上与其相关序列进行同 源比对，比对结果显示 CYS4 菌株与枯草芽孢杆菌的同源性大于 99％，其中与枯 草芽孢杆菌 CD-23（EU670050.1）的相似性达到 100％，结合 CYS4 菌株的培养特 征、形态特征以及生理生化特性，初步确定 CYS4 菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。 通过单因素试验和正交试验来优化 CYS4 菌株的产酶条件，研究发现最佳发 酵培养基为：5％魔芋粉、2％酵母粉、0.6％KH2PO4、0.03％MgSO4；最佳培养条 件是培养温度为 40℃、接种量为 7％、初始 pH 值为 7.5。在此条件下培养 48h， CYS4 菌株产生的 β-甘露聚糖酶活力为 20.67U/mL，是优化前的 4.02 倍。 对枯草芽孢杆菌CYS4菌株所产的β-甘露聚糖酶的酶学性质进行初步研究，初 步确定酶促反应的最适pH值为7.0，在pH值为5.0~11.0时能保持很好的稳定性，37℃ 处理2h酶活力仍在80％以上；酶促反应的最适温度为60℃，在低于40℃的温度下 基本稳定，保温3h酶活力仍然有70％以上；Na+、Fe2+、Mg2+等金属离子对该酶有 激活作用，Hg+对酶活有一定的抑制作用。 关键词：β-甘露聚糖酶；分离；鉴定；枯草芽孢杆菌；发酵条件；酶学性质 ABSTRACT β-Mannanase is an endo-wise glycosyl hydrolase catalyzes random hydrolysis of β-1,4-mannosidic linkages in the main chain of mannan and it is a kind of hemicellulases. Mannanase existed widely in animals, plants and microorganism. Mannanase has wide commercial applications in industry processes such as foodstuff, pharmaceutical, feed, paper and pulp industry. Konjac oligosaccharide has a variety of physiological functions, the mannanase hydrolysis konjac could be used to produce purity oligosaccharide which has a bright future. 36 β-mannanase producing strains were isolated from soil and factory waste liquid. One strain named CYS4 was obtained after screening by determining mannanase activity in DNS method, its enzyme activity was 5.14 U/mL. The research also found that the CYS4 strain is a exocelluar β-mannanase producing strain. 16S rDNA sequence of CYS4 strain was determined, comparative 16S rDNA sequence analyses revealed that CYS4 strain was most related to Bacillus subtilis(Identities99 ％ ), the similarity of Bacillus subti