Clin ProTol结合质谱分析弓形虫急性感染小鼠血清多肽.docVIP

Clin ProTool结合质谱分析弓形虫急性感染小鼠血清多肽 　　摘要：为分析血清差异表达多肽，并寻找具有潜在诊断意义的弓形虫感染标志物，建立弓形虫急性感染小鼠模型，采集急性感染组与健康对照组小鼠的血清，采用包被C8基团的磁珠纯化试剂盒富集血清多肽，应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF Mass Spectrometry）检测，采用flexanalysis 2.0软件、Clin ProTools软件分析检测图谱并建立检测模型。在m/z 800～12 000 区段，比较急性感染组、健康对照组的小鼠血清，共有8个峰存在显著性差异，其中m/z 1 788.99、1 971.85、5 004.32、7 500.89、5 817.47区段的5个多肽峰的表达均显著上调，而m/z 1 849.00、8 115.66、4 056.31区段的3个峰则显著下调，应用Clin ProTools建模方程建立感染小鼠的检测模型。MALDI-TOF质谱结合Clin ProTools分析可建立弓形虫感染检测的新方法，为弓形虫的诊断提供新思路。 中国论文网 /1/viewhtm　　关键词：弓形虫；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；磁珠富集 　　中图分类号： S855.9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0240-02 　　。弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫，可导致严重的人兽共患寄生虫病，可在人与牛、羊、猪、鸡、猫等多种动物间传播[1]，严重危害人类健康[2]与畜牧业发展[3]。部分猪场的流行病学调查显示，弓形虫感染率较高，最高达96%[3-4]，兽类、鸟类、灵长类等野生动物的弓形虫抗体总阳性率为22.7%[4-5]，人类尤以孕妇的感染为主[6-7]，可见该病具有重要的公共卫生意义。目前，该病的防控主要以控制传染源、加强疾病诊断为主，尚无理想的药物和疫苗[8-9]。该病在猪等家畜的发病率、病死率均很高，其常规诊断以实验室检查为主，包括病原学和血清学检查[9]。病原学检查主要以动物内脏组织做涂片，或动物接种后检查腹腔液虫体，发现病原体后确诊，此方法稳定可靠，但费时费力且检出率低。血清学方法主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接血凝试验（IHA）、间接免疫荧光抗体试验（IFA）、PCR检测等，血清学方法操作简便、快捷，但特异性和敏感性不高，且易产生假阳性[10]。该病的早期诊断对于畜牧生产具有重要的经济与社会意义；因此，在动物活体上建立快速、准确的弓形虫感染检测方法，是目前亟待解决的重要课题。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）结合Clin ProTool软件分析是血清临床蛋白质组学研究的主要分析技术之一[11]，具有高通量、高灵敏度、易操作等优点，已被用于包括寄生虫病等诸多疾病标志物的研究和临床诊断[12]。本研究以试验动物小鼠为模型，分析弓形虫急性感染组、健康对照组小鼠血清多肽图谱的差异，建立一种弓形虫感染诊断的新方法，为家畜弓形虫病的诊断及研究提供新的思路和应用价值。 　　1材料与方法 　　1.1试验动物与试剂 　　试验动物为40只Balb/c小鼠，5～6周龄，雌雄各半，每只体质量18～20 g，购自扬州大学比较医学中心（编号：SYXK2007-0003）。将小鼠分为弓形虫急性感染组、健康对照组，每组各20只。试验弓形虫虫种为弓形虫国际标准株（RH株），来自扬州大学寄生虫教研室。 　　主要试剂：WB-C8磁珠纯化试剂盒（Bruker Daltonics公司）；丙酮、甲醇、异丙醇、乙腈、三氟乙酸、甲酸等均为色谱纯级；基质：HCCA（α-氰-4-羟肉桂酸），300 mg/L，溶于乙醇-丙酮（2 ∶1），新鲜配制。 　　1.2方法 　　1.2.1弓形虫感染小鼠模型的建立取弓形虫国际标准株（RH株）感染72 h的小鼠腹水，用生理盐水将纯化的弓形虫速殖子调整为浓度1×104个/mL的悬液。弓形虫急性感染组每只小鼠腹腔注射悬液0.2 mL，健康对照组每只小鼠腹腔注射灭菌生理盐水0.2 mL。 　　1.2.2血清样本采集感染后5 d于小鼠眼眶采血，每只采取全血0.5 mL，并立即置于4 ℃冰箱保存，30 min后以 12 000 r/min、4 ℃离心10 min，分离血清并冷冻于-80 ℃冰箱待测。以同样方法采集健康对照组小鼠血清。 　　1.2.3血清WCX磁珠处理根据试剂盒标准操作规程，将10 μL样本结合液与10 μL C8磁珠试剂混合，轻轻混匀后，加入10 μL完全融解的血清样本至200 μL PCR管，混匀并于室温静置5 min；将PCR管放入磁珠富集器（MBS），使磁珠贴壁并弃上清；利用冲洗液（WS，wash so