生物技术制药3.2基因工程菌的稳定性.pptVIP

基因工程菌生长代谢的特点 对菌体生长的调控主要有两种观点：一种认为能量的供应决定了菌体的最大比生长速率；另一种认为是小分子前体和催化组分等等的限制决定了菌体的最大比生长速率。 菌体生长与能量的关系 当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物乙酸。产生乙酸的机制还不完全清楚，一般认为是由于呼吸链或三羧酸循环的供能不足，使部分乙酰辅酶A通过转化为乙酸来供能。高浓度的乙酸能明显抑制菌体的生长。 基因工程菌生长代谢的特点 分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、连续培养中控制稀释速率等培养方法，都能在一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用，以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平。 实质：控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的产生，以降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌体生长速度。 基因工程菌生长代谢的特点 菌体生长与前体供应的关系 由于菌体中小分子前体量和催化结构是有限的，因而生物大分子和合成处于亚饱和状态，限制了菌体的比生长速率。基因表达在各个水平的竞争又是各个基因互相竞争共同的前体和催化结构的结果。由于基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主 基因工程菌生长代谢的特点 细胞竞争共同的前体和催化结构，从而加剧了这些成分的不足，因而在同样的培养基中，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，特别是工程菌诱导后，由于外源基因的大量表达，引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞。 “严紧反应”：当氨酰tRNA不足时，核糖体在密码子上停留，合并称为“魔点”的ppGpp的结果。 基因工程菌的发酵工艺 基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺的区别： （1）生物材料方面（2）生产目的方面 培养基的影响 常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。 常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。 另外还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。 基因工程菌的发酵工艺 接种量的影响 接种量是指移入的种子液体和培养液体积的比例。接种量小，不利于外源基因的表达，大接种量有利于对基质的利用，缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但接种量过高又会抑制后期菌体的生长。所以接种量大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度。 温度的影响 温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成水平上。 基因工程菌的发酵工艺 在复制水平上，可通过调控复制，改变基因拷贝数，影响基因表达；在转录水平上，可通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，来调控基因表达；温度也可在mRNA讲解和翻译水平上影响基因表达，温度还可能通过细胞内小分子调节分子的量而影响基因表达，也可通过影响细胞内ppGpp量调控一系列基因表。 温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。 基因工程菌的发酵工艺 溶解氧的影响 溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。 外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。 通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。 基因工程菌的发酵工艺 诱导时机的影响 一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。 pH的影响 pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。 总之,最佳化的工艺是获得: 最快周期、最高产量、最好质 量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度和最低失败率等。 * * 第一节 基因工程菌的稳定性和生长代谢的特点 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 改善基因工程菌不稳定性的策略 基因工程菌的稳定性 基因工程菌的遗传不稳定性的表现 基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性， 这种 不稳定性具有下列两种表现形式： 结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表 观生物学功能的丧失 分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中逃逸（curing） 基因工程菌的稳定性 基因工程菌的