真核细胞中核酸的分离(2008.12讲).pptVIP

分子生物学实验 真核细胞中核酸的分离 ——肝细胞核、染色质及DNA的分离 目的和要求: 了解分离亚细胞结构成分的基本原理 学习细胞组分分析的基本过程 掌握离心分析技术 培养对分子生物学实验的直观感受 原 理: 整体 ? 组织 ? 细胞 ?（细胞器） ? 分子 动物肝脏 ? 肝细胞 ? 细胞核 ? DNA 实验流程： 动物肝脏 肝细胞 分离肝细胞核 得到粗染色质成分 分离DNA 试剂与器材： 主要试剂（参阅P109 ）： 1. 等渗缓冲液，pH7.5 7. 氯仿︰异戊醇（9︰1 V/V） 2. 低渗缓冲液，pH7.5 8. 无水乙醇及70%乙醇 3. 5mol/L NaCl 9. 琼脂糖 4. 裂解液 10. SYBR GREEN（荧光染料） 5. TE 11. 1×TBE电泳缓冲液，pH8.3 6. Tris-饱和酚 12. DNA上样缓冲液 主要器材: 台式微量离心机 操作步骤 （1）取肝组织1g,将200目尼龙布放在研钵中，加等渗缓冲液5ml后，用研磨棒反复挤压肝组织，释出肝细胞。 （2）每人收集细胞悬液1ml于5ml离心管中,5000rpm，离心1分钟，收集细胞。 （3）小心倾去上清，用加DNA提取液1ml重悬细胞,加入10ul蛋白酶K溶液, 37℃,水浴1小时。 （4）加入1ml饱和酚(下层),颠倒离心管混匀, 5000rpm，离心5分钟。 （5）取上清于另一离心管中，加等体积酚︰氯仿，混匀,5000rpm，离心，5分钟。 （6）小心取上清于另一离心管，加2倍体积的无水乙醇，混匀,室温放置10分钟, 5000rpm，离心5分钟，小心倾去上清液。 （8）加75%乙醇1ml洗沉淀一次，5000rpm，离心5分钟，小心倾去上清。 （9）将离心管倒置（5-10分钟）使沉淀晾干，加TE溶液500ul溶解. （10）取基因组DNA溶液200ul,加入1800ul水, 测定OD值. （11）另取10ul基因组DNA溶液,加10ul水,再加入 6×DNA上样缓冲液4ul,电泳. 4. DNA的电泳 （1）安装凝胶模具，调节样品梳，使其距底板0.5～1.0mm。 （2）配制0.7%琼脂糖凝胶：称取电泳用琼脂糖0.7g，加1×TBE电泳缓冲液100ml，置沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖熔化。 （3）待凝胶冷却至60℃，用吸管取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，待其凝固后，再将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中（凝胶厚度为3～5mm）并放置样品梳。 （4）待凝胶完全凝固后（0.5-1小时），小心移去样品梳，置电泳槽内放平，加入恰好没过胶面约1mm深的1×TBE电泳缓冲液。 （4）取DNA溶液20ul，加6×DNA上样缓冲液4ul，混匀后，用微量移液器慢慢将混合物加至样品槽中。 （5）盖上电泳槽并通电，电压150V，电泳约1～2小时。 操作步骤（五） 5. 染色质和DNA的光吸收图谱比较 （1）取适量染色质（50ul）及DNA溶液100ul，分别用水稀释到3ml，混匀。 （2）用紫外分光光度计分别作200～300nm波长的光谱扫描并记录其吸收光谱。 * *YL * 常用生物学研究的水平： 真核细胞的破碎： 物理方法：包括超声波法、匀浆法、液氮破碎法等，但这些物理操作均易导致DNA链的断裂。 通常采用较温和的生物和化学的方法： 低渗结合去污剂的方法，除去红细胞及肝细胞膜 通过差速离心，把比重较大的细胞核从细胞质成分和碎片的悬浮液中沉淀下来 分离得到粗的细胞核和染色质 （可用蛋白酶K消化去除DNA中结合的蛋白质，）并进一步用酚，氯仿︰异戊醇等有机溶剂去除蛋白，得到纯度较高的DNA。 原 理: 挤压，200目尼龙布过滤 低渗，裂解细胞，离心 裂解细胞核，离心 表面活性剂处理及有机溶剂抽提，去除蛋白质成分 DNA电泳检查其完整性 吸收光谱扫描，比较样品的纯度 实验技术： 离心技术、分光技术、电泳技术 点样： DNA的光吸收图谱 * * * * * * * * * Liver DNA 用EtBr（溴化乙锭）作染料的DNA在UV下的图象 用 Sybr Green作染料