纸层析法观察转氨基反应.pptVIP

纸层析法观察转氨基反应 实验目的 1.学习氨基酸纸层析的基本原理 2.掌握氨基酸纸层析的操作技术 实验原理 α-酮戊二酸与丙酮酸在肝脏丙氨酸氨基转移酶(ALT)催化下的转氨基作用 实验原理 纸层析是以滤纸作支持介质,水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相.某些与水不相容的有机溶剂如醇,酚等为常用的流动相.把预分离的物质加在纸的一端,使流动溶剂经此向另一段移动,这样物质随着流动相的移动进行连续,动态的不断分配.由于物质分配系数的差异,而是移动速度不一样,达到分离的目的. 实验材料和仪器: 一.仪器: 剪刀,镊子,托盘,培养皿,表面皿,毛细管,喷雾器, 吹风机,水浴箱,电炉. 二.试剂: 1．0.01mol/L pH7.4 磷酸缓冲液： 2．0.1mol/L 丙氨酸： 3．0.1mol/L-谷氨酸： 4．0.1mol/L-α-酮戊二酸： 5．层析溶剂 ：酚的饱和水溶液 6．0.5%（W/V）茚三酮 实验步骤 1．肝匀浆制备： 称取新鲜肝0.5克剪碎,加入4.5ml(9倍体积) 0.01mol/L pH7.4 磷酸缓冲液用研钵研磨过滤取上清备用. 2．转氨基反应 图2-2 滤纸点样示意图:1.测定管上清液; 2. 0.1mol/L丙氨酸3.对照管上清液; 4. 0.1mol/L谷氨酸 3．层析： 取直径9cm圆形层析滤纸一张,通过圆心作一半径为1cm的圆,在圆周上分别取4等距点分别作测定管和对照管溶液及标准丙氨酸、谷氨酸的点样位置.点样时,将毛细管轻轻靠到滤纸上(不能损伤滤纸),使斑点直径不能超过5mm.为了有足够量的样品点在滤纸上,每种样品应重复点1~2次,每次点样后待自然风干,再点下一次. 在滤纸圆心处打一小孔,另取一滤纸小条将其下端剪成刷状,卷成“灯芯”插入中心小孔处,使“灯芯”不突出纸面.然后将该层析圆滤纸平放在盛有水饱和酚的培养皿上,纸芯下端须状部分浸入溶液中,再在层析滤纸上罩一个大小合适的表面皿,溶剂沿纸芯上升到滤纸,再向四周扩散,待溶剂前沿到达距康维皿边缘1cm处时 (约25min左右),取出层析滤纸,去掉纸芯,记下溶剂前沿, 烘干以除去酚溶剂. 将已烘干的滤纸平放于表面皿上,用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.5%茚三酮溶液至滤纸全部湿润.烘干即可看到紫红色斑点,比较各色斑点的位置及色泽深浅,计算Rf值,分析是否发生了转氨基反映. 注意事项: 层析液含有腐蚀性酚,防止溅到眼睛和皮肤. 操作中接触滤纸前要洗手擦干,并尽量避免手与滤纸中央部位接触. 点样不宜过大,直径小于5mm. * * 周 鹏 Rf = 测定管?加入10滴肝匀浆?37℃水浴10min?冷却?加入反应物* ?37℃水浴30min?沸水浴10min 对照管?加入10滴肝匀浆?100℃水浴10min?冷却?加入反应物* ?37℃水浴30min *: 0.1mol/L 丙氨酸10滴, 0.1mol/L-α-酮戊二酸10滴, 0.01mol/L pH7.4 磷酸缓冲液1.5ml