中国医科大基础医学遗传学课件基因操作.ppt

* 七、DNA测序（Sequencing） Sanger法 * * * * * 第三节??? DNA多态 DNA多态（DNA Polymorphism）： DNA区域中等位基因(或片段)存在两种或两种以上形式,对基因没有影响,称为DNA 多态。 群体中每个个体（体细胞）的两套单倍体DNA是不完全相同的，一般每100~500bp就有一个是不相同的，它们多位于内含子序列中，表型并没有改变，这种表现称为DNA多态。 除一卵双生子外，没有两个个体的基因组DNA是完全相同的。 常用做遗传分析中的标记遗传标记 * DNA分析中常用的多态性标记有3类： 1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记； 2）重复序列多态性：短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记； 3）单碱基多态性（SNP）：DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。 * 一、序列多态（或点多态） 限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP ）。 由于碱基的变异可能导致限制酶切点的消失或新的酶切点出现，从而引起不同个体的DNA在用同一限制酶切割时，产生DNA片段长度的差异。这种由于酶切位点变化导致的DNA片段长度的差异称为RFLP。 解释RFLP分析时应记住三项事件： 1） RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传; 2）RFLP碱基改变本身不是致病基因原因（中性 突变）; 3）杂合子提供信息。 是非常有用的遗传标记。 * Allele II 产生了新的酶切点 Allele I Allele II 12Kb 8Kb 4Kb probe 12Kb 8Kb RFLP—Southern blot检测结果 * AlleleII酶切位点消失 * 二、序列长度多态性（或数目变异串联重  复，variable number tendom repeats, VNTR） 重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次重复，称为串联重复序列。散在地分布于染色体上，以插入/缺失方式形成多态。如图： VNTR两侧的酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。 * VNTR 酶切，电泳后的检测结果 大 小 * PCR-VNTR检测 *  通常，重复单位6~28bp长，称为小卫星DNA。 重复单位2~6bp长，如（TA）n, (CGG)n等，称为微卫星DNA。DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）? * PCR-VNTR * VNTR * 生物芯片技术 九十年代以来，发展了一种新的分子生物学技术，引起了人们的极大关注。生物芯片，实际上是一种微型多参数生物传感器。它通过在一微小的固体载体表面固定大量的分子识别探针，构建一组微分析单元和系统，以实现对化合物，蛋白质，核酸，细胞或其他生物组分准确，快速，大量的筛选或检测。 基因芯片（又称DNA芯片，生物芯片，DNA探针微列阵），它集成了大量的密集排列的基因探针，通过与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实现核酸序列的分子识别。能在同一时间内分析大量的基因，实现生物基因信息的大规模检测。 * 基因芯片 如： 靶基因 基因组 特异性片段 探 针  AGCTTAGC 靶序列 TCGAATCG probe ? ? ? A B C 1 2 3 4 5 检测 * * C B * 生物芯片（Biochip） * * 基因芯片的应用： 一、基因组扫描 二、寻找基因功能 三、基因型及单碱基多态性（SNP） 四、突变检测 五、基因表达 * END * * * 随机引物标记探针 5` 3` 5` 5` 3` DNA 32p-dNTP,Bio-Dntp 6bp primer Klenow,dNTP 变性-复姓 * 3、DNA末端标记 * 二、DNA杂交常用的方法 （一）.Southern blot 1975年，英国科学家Southern首创，是指DNA-DNA杂交，是经典的基因分析方法。 1、原理