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发酵过程葡萄糖在线检测系统研制 　　摘 要 发酵工艺中的高温蒸气灭菌过程使得传统“酶膜”方式葡萄糖生物传感器不能在线使用，导致不能实时控制葡萄糖的补加量，进而影响发酵的质量和产率。为了解决这一问题，本研究构建了一套用于发酵过程的葡萄糖在线检测系统。利用研制的耐高温的“酶液”方式葡萄糖生物传感器解决了“酶膜”方式传感器高温后无法正常工作的问题；利用研制的耐高温的透析取样系统解决了在线取样难题。实验表明： 本传感器对葡萄糖的灵敏度达到0.259 nA/（mg/L）； 检出限为0.7 mg/L。 对于500 mg/L葡萄糖浓度测量结果的相对标准偏差为2.02%；在0～1000 mg/L范围内，系统响应信号与葡萄糖浓度呈线性关系；本系统与商品化SBA-40E 生物传感分析仪离线测量结果相比，呈现显著的线性相关关系。且线性相关方程的斜率k≈1。利用此检测系统对大肠杆菌发酵过程中的葡萄糖浓度进行了在线测量，并与SBA-40E 生物传感分析仪离线测量结果进行了对比，变化趋势基本一致。 　　关键词 发酵过程； 葡萄糖浓度； 在线测量； 酶注射式； 生物传感器 　　1 引 言 　　葡萄糖是发酵过程中菌体生长和产物合成的主要碳源，但必须控制其在发酵液中的浓度。在发酵前期，如果葡萄糖浓度过高，容易对菌体生长产生阻遏、抑制和限制作用；在发酵后期，如果葡萄糖浓度过低，则会限制菌体生长和产物合成。需特别注意的是流加的葡萄糖量，即使是超出最适浓度范围的微小波动都将引起严重的阻遏或限制。在发酵过程中，为了防止染菌，发酵罐等设备需要经过高温蒸气灭菌，这会导致常用的“酶膜式”葡萄糖生物传感器所用的生物酶的活性下降或丧失[1]。因此，葡萄糖浓度一般都通过在实验室离线化验取样样本获得。依据测定结果实施间歇式的补料，而间歇式补料容易引起糖浓度的剧烈变化，造成罐内环境（如渗透压）不稳定，从而对菌体代谢活性及最终发酵生产带来负面影响，进而影响发酵的产率和质量。因此，葡萄糖在线测量仪器的研制具有重要意义。 　　与常见葡萄糖检测方法，如菲林滴定法[2]、氧化酶-偶联比色法（GOD-POD法）[3]、气相色谱法[4]、高效液相色谱法[5]及气相色谱-质谱法[6]相比，葡萄糖氧化酶-电极法[7～10]具有特异性强、适于在线、分析速度快等优点。因此，以葡萄糖氧化酶-电极法为原理的葡萄糖酶电极生物传感器（以下简称为葡萄糖生物传感器）及以葡萄糖生物传感器为核心部件的葡萄糖分析仪均得到了广泛地研究与应用[11]。例如，美国YSI公司的YSI2300 STAT PLUS葡萄糖乳酸分析仪、德国EKF公司的BIOSEN C_Line葡萄糖/乳酸分析仪和中国山东省科学院生物研究所研制的SBA系列生物传感分析仪，均采用“酶膜”方式葡萄糖生物传感器，主要用于医疗血糖及发酵工业葡萄糖的离线测量，由于酶的生物活性经高温灭菌会失活，因此“酶膜”方式葡萄糖生物传感器不能与发酵罐直接连接，导致不能在线使用[1]。瑞典Chemel AB 公司的SIRE系列葡萄糖分析仪，采用“识别物质注射”方式葡萄糖生物传感器，主要用于食品、发酵工业葡萄糖的离线测量。该生物传感器采用的探头方式，通过透析膜将传感器与待测液隔开。如果将探头插入发酵罐中，注射的酶液、流入的缓冲液以及酶促反应后的废液将会污染发酵液，因此不能直接插入发酵罐中进行葡萄糖浓度的在线测量[12]。而Min等利用在线FIA结合微透析取样和双生物传感器，实现了发酵过程葡萄糖和L-乳酸的同时监测[13～15]。 　　本研究构建了发酵过程的葡萄糖在线检测系统（以下简称为检测系统）。其中，研制的新型酶注射式葡萄糖生物传感器，能够承受高温蒸气灭菌，并因采用“新鲜”酶液，而不用频繁校准，其对葡萄糖的灵敏度达到0.259 nA/（mg/L）；检出限为0.7 mg/L。对于500 mg/L葡萄糖浓度测量结果CV值为2.02%[16]；自行设计的透析取样系统实现了检测系统的在线取样，同时减少了待测液的消耗。通过相关实验研究，验证了此检测系统应用于葡萄糖浓度在线测量的可行性。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　SBA-40E葡萄糖生物传感分析仪（山东省科学院生物研究所）。葡萄糖标准液，来自山东省科学院生物研究所。磷酸盐缓冲液，由山东省科学院生物研究所SBA系列分析仪专用缓冲剂添加蒸馏水配制。葡萄糖氧化酶液，由葡萄糖氧化酶（型号G7141，312 U/mg，美国Sigma公司）添加磷酸盐缓冲液配制。 　　2.2 葡萄糖在线检测系统 　　本研究构建的葡萄糖在线检测系统结构如图1所示。系统主要由透析取样系统、酶液定量注射装置、酶注射式葡萄糖生物传感器、三电极检测电路（即恒电位仪电路[17～19]）和DSP数据采集电路等组成。 　　系统工作过程如下：首先透析取样探头从