第五章 分子克隆常用的工具酶PPT.ppt

基因工程的基本程序 载体质粒 外源DNA片段 外源DNA插入 剪切 引入宿主细胞 选出含有重组DNA的细胞扩增表达 a b b A A b 第五章?????? 分子克隆常用的工具酶 第一节??????? 限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割 第二节??????? DNA连接酶和DNA分子的体外连接 第三节??????? 其他工具酶 第一节??????? 限制性核酸内切酶与DNA分子的体切割 限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 一、寄主控制的限制与修饰作用如图5-1，图5-2 二、限制性核酸内切酶的制备方法 三、限制性核酸内切酶分类和命名 四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 五、影响限制性内切酶活性的因素 分类： Ⅰ Ⅱ Ⅲ ⅠⅢ ：识别位点附近切割DNA，切割位点难以预测。 Ⅱ ：能在识别位点处切割DNA，切割位点固定 四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 识别序列 ：1.4~7个核苷酸组成的特定核苷酸序列 2.回文结构：两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。 EcoRⅠ 5 ’-G AATTC-3 ’ 3 ’-CTTAA G-5 ’ 2.平末端 如:SmaⅠ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’ 两种特殊的限制酶 (1)同尾酶 识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的两种酶。如：BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ (2)同裂酶 识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两种酶 。如:Mbo Ⅰ和Sau3AⅠ共同识别序列GATC ，但对GmeATC切点,前者不能切，后者能切。 五、影响限制性内切酶活性的因素 1.DNA的纯度 2. DNA的甲基化 （1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌 （2）研究基因工程DNA的甲基化程度 （3）改变限制酶的识别特性 3.温度 4.分子结构 5.限制酶的缓冲液 星号活性 EcoRⅠ GAATTC pupuATpypy EcoRⅠ* 第二节??????? DNA连接酶和DNA分子的体外连接 一、DNA连接酶 DNA连接酶（Ligase）是一种能够催化在双股DNA链的3′-OH和5′-P之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互补粘性末端或平端以及缺口修复，不能连接单链DNA. 温度 二、DNA分子的体外连接 二、DNA分子的体外连接 1．粘性末端DNA片段的连接和单切点的磷酸化 2．平末端DNA片段的连接 （1）T4DNA连接酶法 （2）同聚物加尾法 （3）用化学合成的衔接物连接DNA分子 第三节??????? 其他工具酶 一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶） 三、T4DNA聚合酶 四、逆转录酶 五、末端脱氧核苷酰转移酶 六、核酸酶S1 七、核酸酶BAL31 八、外切核酸酶Ⅲ 九、T4多聚核苷酸激酶 十、碱性磷酸酶 十一、??? 甲基化酶 命名 HindⅢ H: Haemophilus 嗜血杆菌属 in: influenzae 流感 d: Rd株 Ⅲ：该菌株中第三个被分离到的限制酶 同尾酶BamHI和BglII ?AGATCT? ?GGATCC? ?TCTAGA? ?CCTAGG? BglⅡ BamHI ?A GATCC? ?TCTAG G? T4连接酶 AGATCC? （连接后的切点均不能被上述两种酶切） TCTAGG? 一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 1.三种活性 （1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP时） （2）3’外切酶活性 （无dNTP时大亚基活性） （3）5’外切核酸酶活性（无dNTP时小亚基活性） 2.在基因工程中的应用 ：缺口平移标记技术。 二、D