第三章临床生物化检验常用技术.pptVIP

常用生物化学检验技术（下）;第一节 光谱分析技术 第二节 电化学分析 第三节 干化学分析技术 第四节 电泳技术 第五节 层析技术 第六节 离心技术 第七节 自动生化分析技术 　　　; 一、电泳的基本原理 二、常用电泳分析技术 三、电泳分析技术在临床中的应用;电泳技术是利用带电粒子在电场作用下定向移动的特性，对混合物组分进行分离、纯化和测定的一项技术。 ;一、电泳的基本原理;带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度。 电泳时，带电颗粒（球形）在介质中受力平衡匀速运动，则有： v = F阻/f = FE/f = E·q/f = E·q/(6π·r·η) v — 泳动度 F阻 — 颗粒所受阻力 FE — 颗粒所受电场力 f — 摩擦系数 由上式可见：泳动度与球形分子半径、介质粘度、颗粒所带电荷以及电场强度有关。 非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动度与粒子形状有关。 ;影响泳动度的因素： 1. 电场强度： 电场强度是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。根据电场强度的不同，电泳可分为： 常压(100-500V)电泳。其电场强度为2-10V/cm。分离时间较长，从数小时到数十小时 ，适合于分离蛋白质等大分子物质。 高压(2000-10000V)电泳。其电场强度为50-200V/cm，电泳时间很短，有时只需几分钟。多用于分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。 ;2. 溶液pH 为使电泳时pH值恒定，必须采用缓冲液作为电极液，溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的多少。 对蛋白质而言，溶液pH值离等电点越远，则颗粒所带的净电荷越多，泳动速度也越快；反之，则越慢。因此分离某种蛋白质混合液时，应选择合适的pH使欲分离的各种蛋白质所带的电荷数量有较大的差异。;3. 溶液的离子强度 缓冲液离子强度越高，则颗粒的电动电势越小，泳动度也越小。一般最适合的离子强度在0.02-0.2之间。溶液离子强度(ionic strength)的计算公式如下： I=1/2Σcz2 式中，I为离子强度，c为离子的摩尔浓度(mol/L)，z为离子价数，价数越高，则离子强度越大。 4. 电渗 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。如纸电泳时，滤纸吸附OH-离子带负电荷，与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影 响，故电泳时，电渗 小些为好。 ;5. 温度 电泳时会产生焦耳热，使介质粘度下降，分子运动加快，迁移率增加，同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活，因此电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。 6.支持物 现代电泳多在固体支持物上进行，使样品中的不同组分形成不同的区带，称区带电泳。电泳结束后，支持物可以方便地进行染色等后续处理。 对支持物的一般要求是均匀，吸附力和电渗小，机械性能好，便于染色或紫外光下检测，故最好透明，无紫外吸收。常用的支持物有滤纸，醋酸纤维素薄膜，淀粉凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶等。 支持物性质不同也会影响泳动速率，如琼脂于聚丙烯酰胺凝胶都有大小不同的筛孔，在筛孔大的凝胶中溶质颗粒的泳动速率快，反之则慢。;二、常用电泳分析技术;1.醋酸纤维素薄膜电泳;灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅需2μL血清，故常用于检测在病理情况下微量 异常蛋白的改变。 应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋 白等用醋酸纤维素薄膜电泳能较好地分离。 易保存，易定量。醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡 后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。 由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、价廉。目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋 白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、酶、多肽、核酸及其他生物大分子。 ;2.琼脂糖凝胶电泳;琼脂糖凝胶的特点： 目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，琼脂糖是经过挑选，以质地较纯的琼脂作为原料而制成的。 优点如下： 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。 电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 ;琼脂糖凝胶的特点： 目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合 ，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1μg