毛细管电泳理及分析策略.pptVIP

欢迎各位老师同学参加贝克曼库尔特公司毛细管电泳交流会（广州） 2008年7月11日 华南师范大学 日程安排 11日： 毛细管电泳原理及分析策略 实验常见问题及分析 仪器使用注意事项 软件操作 12日（Optional）： 仪器、实验现场操作 毛细管电泳分离原理及分析策略 张鹏 产品经理Peng_zhang@ 美国贝克曼库尔特公司 CE分离原理-与模式有关 毛细管区带电泳（CZE） 毛细管胶束电动色谱（MECC/MCKC） 毛细管凝胶电泳（CGE） 毛细管等电聚焦（cIEF） 亲和毛细管电泳（ACE） 毛细管电色谱（CEC） 第一章 毛细管区带电泳 进样方式 毛细管种类 非涂层毛细管（裸管） 内壁涂层毛细管（涂层管） 非涂层毛细管-电渗流的概念 电渗流的作用 电渗流是CE中最大的驱动力来源之一 电渗流的正面及负面作用 正面作用 增加分离速度 使得正、负电荷物质同时分离 负面作用 减少分离时间和分离有效距离 电渗流的波动极大的影响了迁移时间的重复性 影响电渗流的因素 pH值 pH越高，电渗流越大 离子强度 离子强度越高，电渗流越小 缓冲溶液添加剂 离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精 电渗流随pH的变化情况 控制电渗流的三个重要手段 采用涂层毛细管，消除电渗流的影响 改变pH，从而调整电渗流的大小。pH3时电渗流很低；当pH10以后，电渗流基本不增加 添加剂：有机溶剂可以降低电渗流的大小，从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以彻底改变电渗流的方向和大小，主要是在阴离子分析时使用 缓冲溶液的影响和选择 在CE中应该根据以下性质来选择缓冲溶液： 在所选的pH范围内有较强缓冲能力； 在检测波长处有低的紫外吸收； 小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的电流。 那些被称为生物“优良缓冲液”的，如Tris, borate, CAPS等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较大，能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。 常用的CE缓冲体系 磷酸钠体系 宽缓冲范围 硼酸钠体系 高pH范围 Tris-HCl体系 低pH范围 醋酸-醋酸铵体系 CE/MS常用体系 CZE分离条件的选择 毛细管类型--涂层还是非涂层？ 毛细管长度--长毛细管还是短毛细管？ 缓冲液体系--种类和pH值 添加剂类型--甲醇|环糊精|乙腈 检测器选择--紫外|二极管阵列|激光诱导荧光 缓冲溶液的选择 可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定（最佳）pH范围后，再进一步细选出更好pH和缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓冲体系之一，它的紫外吸收低，pH缓冲范围比较宽（pH=1.5～13），但电导也比较大。 缓冲溶液及pH值的选择 研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两性样品，采用酸性（pH 2）或碱性（pH＞9）分离条件，比较容易得到好的分离结果；糖类样品通常在pH=9～11之间能获得最佳分离；羧酸或其他样品多在pH=5～9之间选择分离条件。 缓冲溶液及pH值的选择 pH 的选择也和所用的毛细管种类有关，许多涂层毛细管只能在一定的pH范围内工作，例如聚丙烯酰胺涂层毛细管，在3＜pH＜8的范围以外工作，其涂层容易水解失效。 缓冲溶液及pH值的选择 在相同的 pH下，不同缓冲体系的分离效果不尽相同，有的可能相差甚远。一般的经验是，能与样品发生相互作用的试剂，有可能就是最好的试剂。一个典型的例子是，在分离糖类和DNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂也适用于其他含邻位羟基或多羟基化合物的分离。 缓冲溶液及pH值的选择 缓冲试剂及pH调节剂的浓度也需要优化。缓冲试剂的浓度一般控制在10～200 mmol/L之间。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其浓度多控制在20 mmol/L附近，而电导小的试剂如硼酸及HEPES等，其浓度可在100 mmol/L以上。有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的，可采用很高（＞0.5mol/L）的试剂浓度，此时要注意减少分离电压，分析速度自然也将随之降低。 添加剂的选择 目的： 改善分离 抑制分析物在毛细管上的吸附 添加剂的选择 甲醇|乙腈（5-50%） 降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果 增加非极性物质的水溶性 环糊精|SDS等表面活性剂 增加分离选择性，提高分析效果 降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果 非极性高分子聚合物 掩蔽毛细管内壁电荷，抑制分子吸附 降低电渗流 形成一定的分子筛，提高分子大小选择性 第二章 毛细管胶束电动色谱 电解质中加入表面活性剂(surfactant，例如SD